1. Biotinylation에 의한 성상세포의 상대적 세포 표면 단백질 발현 결정
참고: 여기에서는 투수성 채널 aquaporin-4(AQP4)의 세포 표면 국소화에 대한 세포외 기질 분자 laminin의 영향 연구에 이 비오틴화(biotinylation) 기술을 적용하는 방법을 설명합니다. 이 분석에 필요한 특수 재료에는 sulfo-NHS-LC-biotin(sulfosuccinimidyl 6-(biotinamido) Hexanoate) 및 streptavidin-agarose resin(재료 표 참조)이 포함됩니다.
- 이 방법을 사용하여 분석 약 2주 전에 피질 성상세포의 배양을 준비하고 75cm2 vented 배양 플라스크에서 성장시킵니다. 성상세포가 80 - 90% 합류할 때 0.05% 트립신을 사용하여 배양 표면에서 분리한 다음 1:3으로 통과시킵니다.
- 분석 48시간 전에 세포가 다시 80 - 90% 융합되면 60mm 세포 배양 접시에 성상세포를 1:3(배양 형식의 변화를 고려)하여 실험이 수행되는 날에 >70% 융합되도록 합니다. 접시 사이에 세포가 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
- 분석 전 16시간에 피펫 라미닌을 배양 배지에 최종 농도 24nM까지 넣고 37°C에서 배양합니다.
- CM-PBS (1X 인산염 완충 식염수 [PBS], pH 7.4에서 100 mg/L MgCl2∙6H2O 및 100 mg/L CaCl2), 비오틴 완충액 (CM-PBS에서 0.5 mg/mL sulfo-NHS-LC-biotin), 담금질 완충액 (CM-PBS에서 50 mM NHS4Cl), 용해 완충액 (25 mM Tris, pH 7.4, 25mM 글리신, 150mM NaCl 및 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA], 1% 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일), 3X 로딩 버퍼(150mM Tris, pH 6.8, 6% 도데실황산나트륨[SDS], 30% 글리세롤, 300mM 디티오트레이톨[DTT] 및 0.01% 브로모페놀 블루) 및 세척 버퍼(10mM 트리스(pH 7.4), 1.5mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
- 인큐베이터에서 성상세포 배양액을 담고 있는 접시를 제거하고 배지를 버립니다.
- 4mL의 식힌 CM-PBS로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다.
- 2mL의 비오틴 완충액을 각 웰에 피펫팅하고 접시를 앞뒤로 몇 번 부드럽게 기울여 완벽한 커버를 보장합니다. 얼음 위에 30분 동안 그대로 둡니다.
- 흡입기를 사용하여 비오틴 완충액을 제거하고 4mL 담금질 완충액으로 교체합니다. 얼음 위에 10분 동안 그대로 두십시오.
- 담금질 버퍼를 흡인하고 동일한 부피로 교체하십시오. 다시 10분 동안 얼음 위에 둡니다.
- 담금질 완충액을 버리고 4mL 냉각 CM-PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
- 세포 리프터를 사용하여 세포를 1mL 냉각 CM-PBS로 긁어내고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 100 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 버리고 500μL의 용해 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다.
- 샘플을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고, 5분마다 와류로 가열하거나 4°C의 엔드 오버 엔드 로테이터에 놓습니다.
- 용해물을 14,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세제에 불용성 물질을 펠릿화합니다. 상등액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 이 용해물을 50μL씩 저장하고 로딩 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 건조한 욕조에서 95 °C로 가열하여 변성시킵니다. 이것은 비오틴화된 세포 표면 단백질과 비오틴화된 세포질 단백질을 모두 포함하는 "입력" 분획입니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 끝에서 약 0.5cm의 재료를 잘라내어 피펫 팁의 개구부를 넓힙니다. 이 피펫 팁을 사용하여 75μL의 streptavidin-agarose beads(일반적으로 4°C에서 보관)를 용해물로 옮기고 shaker/rocker에서 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.
- 스트렙타비딘-아가로스는 항균 용액에 현탁된 부피 기준으로 50%의 비드를 함유하는 슬러리로 판매되는 경우가 많으므로 비드가 고르게 부유하도록 슬러리를 분쇄한 다음 각 샘플에 현탁액 150μL를 피펫팅합니다.
- 펠렛 streptavidin-agarose 비드를 1500 x g에서 4 °C에서 30 초 동안 원심 분리
.
- 상등액의 50 μL를 절약하십시오 (loading buffer를 추가하고 수조 또는 가열 블록에서 95 °C에서 변성); 이것은 "intracellular" 분획을 나타내며 주로 non-biotinylated cytosolic proteins로 구성됩니다.
- 펠릿화된 비드를 1mL 세척 완충액에 재현탁하고 4°C에서 3분 동안 흔들어 놓습니다.펠렛 비드를 (1.16단계 참조) 상층액을 버립니다. 이 과정을 4회 반복하여 비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화합니다.
- 원심분리(4°C에서 30초 동안 1500 x g)로 비드를 펠렛화하고 위에 있는 세척 버퍼를 버립니다. 50μL의 1X 로딩 버퍼(용해 버퍼를 사용하여 희석)를 추가합니다. 비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 95 °C에서 변성시켜 방출합니다. 이 분획은 비오틴화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다("세포 표면" 분획).
- SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기영동)에 의한 별도의 입력, 세포 표면 및 세포 내 분획을 분석하고 western blotting.
로 분석합니다.
메모: 우리가 우리의 실험에 있는 4 - 20% 미리 틀에 넣어 만들어진 기온변화도 젤을 사용하는 동안, 4% 겹쳐 쌓이는 층을 가진 12 - 14% 분리 젤 (각각 0.1% SDS를 포함하는)는 이 학문에 있는 관심사의 단백질을 위해 충분해야 합니다. 적절한 크기 범위의 분자량 표준도 사용해야 합니다. 비오틴화된 단백질의 겉보기 분자 질량에서 때때로 관찰 가능한 상향 이동이 있을 수 있습니다.