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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 비오틴화(Biotinylation)에 의한 성상세포(Astrocyte)의 세포 표면 단백질의 내재화율(Internalization Rate)
결정
참고: 다음에서는 성상세포에서 AQP4의 세포내이입(endocytosis)을 추적하기 위해 이 사례에서 사용된 일반적인 펄스 추적 비오틴화(biotinylation) 실험에 대해 설명합니다. 필요한 특수 재료에는 sulfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agarose 수지, 환원 글루타티온 및 요오드 아세트아미드가 포함됩니다(재료 표 참조).
- 이전 섹션에서 설명한 방법을 사용하여 60mm 접시에서 마우스 피질 성상세포의 배양을 준비합니다. 분석 당일에 세포가 약 70% 합류하고 각 접시에 동일한 수의 세포가 포함되어 있는지 확인합니다.
- CM-PBS 또는 인산염 완충 식염수(1X PBS에서 100mg/L MgCl2∙6H2O 및 100mg/L CaCl2, pH7.4), 비오틴 완충액(CM-PBS에서 0.5mg/mL sulfo-NHS-SS-비오틴), 환원 완충액(50mM 감소된 글루타티온, 75mM NaCl 및 75mM NaOH), 담금질 완충액(50mM 요오드아세트아미드, 1% BSA, CM-PBS), 용해 완충액(25mM Tris, pH 7.4, 25mM 글리신, 150mM NaCl 및 5mM EDTA 또는 에틸렌디아민테트라아세트산, 1% 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일), 3X 로딩 완충액(150mM Tris, pH 6.8, 6% SDS 또는 도데실황산나트륨, 30% 글리세롤, 300mM DTT 또는 디티오트레이톨 및 0.01% 브로모페놀 블루), 및 세척 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 1.5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
- 신선한 세포 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 또는 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 DMEM)을 준비하고 37°C 수조에 넣습니다.
- 인큐베이터에서 성상세포 배양물을 제거하고 흡입기를 사용하여 배지를 흡
인합니다.
- 4mL의 식힌 CM-PBS로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다.
- 각 접시에 3mL 비오틴 완충액을 피펫팅하고 용기가 잘 분포되도록 접시를 앞뒤로 몇 번 기울인 다음 얼음에 30분 동안 그대로 둡니다.
- 비오틴 완충액을 흡인하고 5mL의 따뜻한 배지로 교체합니다. 배양 접시를 37°C에서 15분 동안 배양하고 두 번째 접시를 같은 온도에서 30분 동안 배양합니다. 다른 접시를 4 ° C에서 0 분 샘플로 그대로 둡니다.
- 배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 4mL의 냉각된 CM-PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 6mL 리듀싱 버퍼를 세포 위에 피펫으로 넣고 15분 동안 얼음 위에 둡니다.
- 환원 완충액을 제거하고 6mL의 새로운 환원 완충액으로 교체합니다. 혼합물을 얼음 위에 15분 더 놓습니다.
- 환원 용액을 제거하고 6mL 담금질 완충액으로 교체합니다. 얼음 위에 15분 동안 그대로 둡니다.
- 담금질 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 담금질 완충액을 버리고 4mL 냉각 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
- 세포 리프터를 사용하여 세포를 1mL 냉각 PBS로 긁어내고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 100 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 버리고 500 μL 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.
- 이것을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고 5분마다 소용돌이치십시오. 또는 이 기간 동안 4°C의 엔드 투 엔드 로테이터에 샘플을 놓습니다.
- 용해물을 14,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세제 불용성 물질을 펠릿화한 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이 용해물의 50 μL를 저장하고, 로딩 버퍼를 추가하고, 건조한 수조에서 95 ° C에서 변성시킵니다. 이것은 비오틴화된 세포작용 단백질과 비비오틴화된 단백질을 모두 포함하는 "입력" 분획입니다.
- 절단된 피펫 팁을 사용하여 스트렙타비딘-아가로스 슬러리 150μL를 용해물에 첨가하고 셰이커/로커에서 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.
- 1,500 x g에서 4°C에서 30초 동안 원심분리에 의한 펠렛 스트렙타비딘-아가로스 비드.
- 비드를 1mL 세척 완충액에 재현탁시키고 4°C에서 3분 동안 록킹합니다.펠렛 비드(단계 1.18에 따름)를 만들고 상등액을 폐기합니다. 이 과정을 4회 반복하여 비비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화합니다.
- 1,500 x g에서 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 펠렛 비드를 만들고 위에 있는 세척 버퍼를 버립니다. 50μL 1X 로딩 버퍼(용해 버퍼를 사용하여 희석)를 추가합니다. 95 °C에서 변성하여 비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 방출합니다. 이 분획은 내재화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다("세포내이입" 분획
).
- Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의한 분리된 입력, 세포 표면 및 결합되지 않은 분획, western blotting.
로 분석
메모: 우리가 우리의 실험에 있는 4 - 20% 미리 틀에 넣어 만들어진 기온변화도 젤을 사용하는 동안, 4% 겹쳐 쌓이는 층을 가진 12 - 14% 분리 젤 (각각 0.1% SDS를 포함하는)는 이 학문에 있는 관심사의 단백질을 위해 충분해야 합니다. 적절한 크기 범위의 분자량 표준도 사용해야 합니다. 비오틴화된 단백질의 겉보기 분자 질량에서 때때로 관찰 가능한 상향 이동이 있을 수 있습니다.