비오틴 유도체를 사용한 표적 표면 단백질의 내재화 평가

초록

출처: Tham, D. K. L., et al., Biotinylation을 사용하여 1차 성상세포 배양에서 단백질의 세포 표면 발현 및 내세포 속도 결정. J. Vis. 특급. (2017).

이 동영상은 비오틴화(biotinylation)를 사용하여 마우스 피질 성상세포의 표적 단백질 내재화를 평가한 후 세포 용해, 스트렙타비딘 기반 단백질 추출, 변성 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 성공적인 내재화를 확인하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 비오틴화(Biotinylation)에 의한 성상세포(Astrocyte)의 세포 표면 단백질의 내재화율(Internalization Rate)

결정

참고: 다음에서는 성상세포에서 AQP4의 세포내이입(endocytosis)을 추적하기 위해 이 사례에서 사용된 일반적인 펄스 추적 비오틴화(biotinylation) 실험에 대해 설명합니다. 필요한 특수 재료에는 sulfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agarose 수지, 환원 글루타티온 및 요오드 아세트아미드가 포함됩니다(재료 표 참조).

1. 이전 섹션에서 설명한 방법을 사용하여 60mm 접시에서 마우스 피질 성상세포의 배양을 준비합니다. 분석 당일에 세포가 약 70% 합류하고 각 접시에 동일한 수의 세포가 포함되어 있는지 확인합니다.
2. CM-PBS 또는 인산염 완충 식염수(1X PBS에서 100mg/L MgCl₂∙6H₂O 및 100mg/L CaCl₂, pH7.4), 비오틴 완충액(CM-PBS에서 0.5mg/mL sulfo-NHS-SS-비오틴), 환원 완충액(50mM 감소된 글루타티온, 75mM NaCl 및 75mM NaOH), 담금질 완충액(50mM 요오드아세트아미드, 1% BSA, CM-PBS), 용해 완충액(25mM Tris, pH 7.4, 25mM 글리신, 150mM NaCl 및 5mM EDTA 또는 에틸렌디아민테트라아세트산, 1% 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일), 3X 로딩 완충액(150mM Tris, pH 6.8, 6% SDS 또는 도데실황산나트륨, 30% 글리세롤, 300mM DTT 또는 디티오트레이톨 및 0.01% 브로모페놀 블루), 및 세척 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 1.5mM EDTA, 150mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1X 프로테아제 억제제 칵테일).
3. 신선한 세포 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 또는 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 보충된 DMEM)을 준비하고 37°C 수조에 넣습니다.
4. 인큐베이터에서 성상세포 배양물을 제거하고 흡입기를 사용하여 배지를 흡
인합니다.
5. 4mL의 식힌 CM-PBS로 세포를 세 번 씻고 으깬 얼음 위에 접시를 놓습니다.
6. 각 접시에 3mL 비오틴 완충액을 피펫팅하고 용기가 잘 분포되도록 접시를 앞뒤로 몇 번 기울인 다음 얼음에 30분 동안 그대로 둡니다.
7. 비오틴 완충액을 흡인하고 5mL의 따뜻한 배지로 교체합니다. 배양 접시를 37°C에서 15분 동안 배양하고 두 번째 접시를 같은 온도에서 30분 동안 배양합니다. 다른 접시를 4 ° C에서 0 분 샘플로 그대로 둡니다.
8. 배양 기간이 끝나면 배지를 버리고 4mL의 냉각된 CM-PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 6mL 리듀싱 버퍼를 세포 위에 피펫으로 넣고 15분 동안 얼음 위에 둡니다.
9. 환원 완충액을 제거하고 6mL의 새로운 환원 완충액으로 교체합니다. 혼합물을 얼음 위에 15분 더 놓습니다.
10. 환원 용액을 제거하고 6mL 담금질 완충액으로 교체합니다. 얼음 위에 15분 동안 그대로 둡니다.
11. 담금질 단계를 한 번 더 반복합니다.
12. 담금질 완충액을 버리고 4mL 냉각 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
13. 세포 리프터를 사용하여 세포를 1mL 냉각 PBS로 긁어내고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
14. 100 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 버리고 500 μL 용해 완충액에 세포를 재현탁합니다.
15. 이것을 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고 5분마다 소용돌이치십시오. 또는 이 기간 동안 4°C의 엔드 투 엔드 로테이터에 샘플을 놓습니다.
16. 용해물을 14,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세제 불용성 물질을 펠릿화한 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 이 용해물의 50 μL를 저장하고, 로딩 버퍼를 추가하고, 건조한 수조에서 95 ° C에서 변성시킵니다. 이것은 비오틴화된 세포작용 단백질과 비비오틴화된 단백질을 모두 포함하는 "입력" 분획입니다.
17. 절단된 피펫 팁을 사용하여 스트렙타비딘-아가로스 슬러리 150μL를 용해물에 첨가하고 셰이커/로커에서 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.
18. 1,500 x g에서 4°C에서 30초 동안 원심분리에 의한 펠렛 스트렙타비딘-아가로스 비드.
19. 비드를 1mL 세척 완충액에 재현탁시키고 4°C에서 3분 동안 록킹합니다.펠렛 비드(단계 1.18에 따름)를 만들고 상등액을 폐기합니다. 이 과정을 4회 반복하여 비비오틴화된 세포질 단백질의 비특이적 결합을 최소화합니다.
20. 1,500 x g에서 4°C에서 30초 동안 원심분리하여 펠렛 비드를 만들고 위에 있는 세척 버퍼를 버립니다. 50μL 1X 로딩 버퍼(용해 버퍼를 사용하여 희석)를 추가합니다. 95 °C에서 변성하여 비드에서 비오틴과 스트렙타비딘을 방출합니다. 이 분획은 내재화된 세포 표면 단백질만 포함해야 합니다("세포내이입" 분획
).
21. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의한 분리된 입력, 세포 표면 및 결합되지 않은 분획, western blotting.
    로 분석 메모: 우리가 우리의 실험에 있는 4 - 20% 미리 틀에 넣어 만들어진 기온변화도 젤을 사용하는 동안, 4% 겹쳐 쌓이는 층을 가진 12 - 14% 분리 젤 (각각 0.1% SDS를 포함하는)는 이 학문에 있는 관심사의 단백질을 위해 충분해야 합니다. 적절한 크기 범위의 분자량 표준도 사용해야 합니다. 비오틴화된 단백질의 겉보기 분자 질량에서 때때로 관찰 가능한 상향 이동이 있을 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A9647-50
브로모페놀 블루	바이오 라드	#1610404
완전한 프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	11697498001
디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트 이수화물(EDTA)	바이오 라드	#1610729
디티오트레이톨(DTT)	바이오 라드	#1610611
Dulbecco의 변형 독수리 매체(DMEM)	Gibco/Thermo Fisher Scientific	11960-044
EZ-Link 설포-NHS-SS-비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	#의 21331
소 태아 세럼	Gibco/Thermo Fisher Scientific	제16000-044
글리세롤	피셔 사이언티픽	BP229-1
글리신	시그마-알드리치	G8898
요오도아세트아미드	바이오 라드	#의 163-2109
L-글루타민	Gibco/Thermo Fisher Scientific	제25030-081
페니실린/스트렙토마이신	Gibco/Thermo Fisher Scientific	15140-122
Peroxidase Affini순수 염소 안티 토끼 IgG (H + L)	잭슨 면역 연구소	Tel.: 111-035-045
인산염 완충액 식염수	Gibco/Thermo Fisher Scientific	제10010-023
글루타치온 감소	시그마-알드리치	G6529 (영문
염화나트륨 (NaCl)	피셔 사이언티픽	시즌 271-500
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	시그마-알드리치	862010
수산화나트륨(NaOH)	피셔 사이언티픽	시즌 318-100
Streptavidin 아가로스 수지	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	#의 20347
토끼 다클론 항-AQP4 항체	알로몬	AQP-004
트리스 베이스(Trizma base)	피셔 사이언티픽	BP152-1
트리스 - HCl	피셔 사이언티픽	BP153-1
트리톤 X-100	피셔 사이언티픽	BP151-500

년 ) 호 호 년 호 ) ) (영문)