해마 뉴런을 이용한 단백질의 매력 또는 반발성 활동 평가

초록

출처: Yamagishi, S. et al., 해리된 해마 뉴런을 사용하여 단백질 기질의 매력 또는 반발 활성을 연구하기 위한 스트라이프 분석. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 패턴화된 단백질 영역에서 해마 뉴런을 사용하여 단백질 활성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 뉴런은 테스트 단백질 영역에서 반발력을 보이고 대조 단백질 영역에서 부착을 나타내어 매력적이거나 반발적인 단백질 활동의 효과를 강조합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 행렬 준비

1. 4-8개의 실리콘 매트릭스를 전자레인지나 핫 플레이트에서 5분 동안 끓이고 층류(줄무늬가 있는 면이 위로 향함)에서 1시간 동안 완전히 건조되도록 합니다.
   메모: 다음 절차는 층류 하에서 수행해야 합니다.
2. 압축 공기를 불어넣거나 투명 접착 테이프를 사용하여 매트릭스의 줄무늬 면에 있는 먼지를 제거합니다. 줄무늬가 있는 면이 플레이트 표면에 단단히 부착될 수 있도록 깨끗하게 유지하십시오.
3. 손가락으로 눌러 6cm 플라스틱 접시에 매트릭스를 조심스럽게 놓습니다(접시당 매트릭스 1개, 줄무늬 면이 아래를 향하게). 매트릭스와 접시 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오. 배양 접시의 아래쪽에 줄무늬의 위치를 표시하십시오.
4. 매트릭스가 연결되지 않으면 1.2단계부터 반복합니다.

2. 뉴런 배양을 위한 스트라이프 생성 및 라미닌 코팅

1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 Fc 태그 단백질(10-50 μg/ml)과 형광 염료 접합 항-human Fc 항체(1 대 3 비율: 30-150 μg/ml)를 혼합하여 형광 표지된 재조합 단백질(주입[2.2단계] 또는 배치 방법[2.2.1단계]의 경우 각각 100μl)을 준비합니다. 그런 다음 RT에서 30 분 동안 혼합물을 배양합니다.
2. 22-G 주사기를 사용하여 이전 단계(2.1)에서 준비한 재조합 단백질 25μl를 매트릭스 측면의 작은 구멍(그림 1A, 1C 및 1E의 화살표)을 통해 주입합니다.
   1. 또는 재조합 단백질 100μl를 매트릭스의 상단 슬릿에 배치하고 재조합 단백질이 줄무늬 영역에 남아 있도록 작은 구멍(그림 1A, 1C 및 1E의 화살표)에서 용액의 약 절반을 흡인합니다.
3. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 접시를 배양합니다.
4. 300μl의 PBS를 상단 슬릿(그림 1B)에 놓고 매트릭스 측면에 있는 작은 구멍(그림 1A, C 및 E의 화살표)에서 흡인하여 부착되지 않은 재조합 단백질을 제거합니다. 단백질이 건조하므로 PBS를 완전히 흡인하지 마십시오. 이 단계를 두 번 반복합니다. (총 3회)
5. 매트릭스를 조심스럽게 제거하고 즉시 ~100μl의 대조 단백질(10-50μg/ml; Fc)를 사용하여 줄무늬 영역 전체를 덮고 대체 코팅을 만듭니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 접시를 배양합니다.
6. PBS로 접시 표면을 세 번 세척한 후 PBS에 20μg/ml 라미닌 ~100μl로 코팅합니다
   메모: 라미닌은 응고를 방지하기 위해 얼음에서 해동해야 합니다.
7. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 접시를 배양합니다.
8. PBS로 접시 표면을 세 번 씻고 배양 배지를 추가합니다. 배양 배지가 있는 코팅된 접시를 사용할 때까지 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에 놓습니다.

3. E15.5 마우스 배아에서 해마 뉴런 배양

1. 경추 탈구를 통해 산모를 안락사시키고 3개의 E15.5 배아를 분리한다.
2. 머리의 정중선에서 피부와 두개골을 가위로 뼈대고 자르고 작은 숟가락을 사용하여 뇌를 제거합니다. 3ml의 Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)이 들어 있는 60mm 페트리 접시에 뇌를 조심스럽게 옮깁니다.
3. 메스를 사용하여 피질, 해마, 선조체를 포함한 반구를 잘라냅니다(그림 2A). 그런 다음 수막을 조심스럽게 제거하여 해마 부위를 절개하고 절개된 해마 조직을 얼음 위에 HBSS 용액 2ml가 들어 있는 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다(그림 2B-C). 튜브에 있는 3개의 배아에서 6개의 해마를 수집하면 8개의 접시에서 뉴런을 배양하기에 충분합니다.
4. HBSS 용액을 트립신/에틸렌디아민 테트라아세트산(트립신/EDTA) 용액(2ml)으로 교체하고 수조에서 37°C에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.
   메모: 원심분리 없이 HBSS를 흡입하고 튜브를 기울여 HBSS 용액을 디캔팅하지 마십시오.
5. 소 태아 혈청(FBS) 500μl를 첨가하여 트립신 활성을 중화합니다.
6. 혼합물을 100 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하고 펠릿을 배양 배지 2ml로 세척합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
7. 조직을 해리하기 위해 큰 구멍(cut-tip)이 있는 1,000μl 팁을 사용하여 배양 배지에서 해마를 위아래로 10회 피펫합니다.
8. 일반(절단되지 않은) 1,000μl 팁으로 변경하고 해리된 조직을 위아래로 피펫으로 하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
9. 단일 세포를 80-100-μm 메쉬 세포 스트레이너에 통과시켜 분리합니다.
10. 여과된 단일 셀 현탁액을 150 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 흡입하여 상층액을 제거하고 펠릿(뉴런)을 배양액 2ml에 재현탁합니다.
12. 트리판 블루 염색이 가능한 혈구계를 사용하여 세포를 세어 밀도와 생존력을 확인합니다. 그런 다음 각 줄무늬 세트에 대해 150μl의 배양 배지에 10,000개의 뉴런을 플레이트합니다. 서스펜션은 전체 줄무늬 영역을 덮도록 조심스럽게 배치해야 합니다.

결과

그림 1. 줄무늬 단백질 스탬프를 만드는 데 사용되는 실리콘 매트릭스. (가, 나) 실리콘 매트릭스의 평면도. 매트릭스의 크기는 30mm x 25mm x 5mm입니다. A의 흰색 화살표는 재조합 단백질이 주입되는 작은 구멍을 나타냅니다(2.2단계). B의 화살촉은 재조합 단백질이 교대로 적용되는 슬릿을 나타냅니다(단계 2.2.1). (C, D) 실리콘 매트릭스의 바닥 모습. 줄무늬 영역의 크기는 7mm x 9mm입니다. 각 스트라이프의 너비는 90μm입니다. 화살표는 재조합 단백질이 주입되는 작은 운하를 나타냅니다. (E) 매트릭스의 정중선에 있는 시상면의 개략도(schematic illustration) 작은 구멍, 줄무늬 및 슬릿 사이의 연결을 보여줍니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 원심분리기 튜브	비올라모	1-3500-01
Alexa Fluor 488 Goat 항인간 IgG 항체	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	A11013
Alexa Fluor 594 Donkey 마우스 IgG 항체	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	A-21203	희석 1/500
B27 보충제	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제17504-044	희석 1/50
소 혈청 알부민	시그마	01-2030-2
셀 스트레이너 100um	BD 팔콘	제352360
원심분리 기계	쿠보타	2410
DAKO 펜	다코	시즌 2002	대체 발수 펜을 사용할 수 있습니다.
일회용 메스	깃털	2975#11
FBS(증권 시세	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	10437-028
겸자 번호 5	정밀 과학 도구	11254-20
글루타맥스	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제35050-061	희석 1/200
해밀턴 시린지	해밀턴	805N	22 게이지, 50 uL
HBSS (하이브에스)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제14170-112
인간 IgG, Fc 단편	잭슨	TEL.009-000-008
라미닌	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	23017-015
뉴로기저	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제21103-049
PBS (PBS)	나칼라이	14249-24
페니실린-스트렙토마이신	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제15070-063	희석 1/100
플라스틱 배양 접시, 60mm	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	150288
실리콘 매트릭스			Martin Bastmeyer 교수(bastmeyer@kit.edu)에서 구매 가능
스테레오 현미경	올림푸스	SZ61
팁, 1000 uL	왓슨	125-1000초
투명 접착 테이프	테사	57315	대체 접착 테이프를 사용할 수 있습니다
트리판 블루, 0.4%	바이오 라드	Tel.145-0013
트립신/EDTA	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	제25300-054
문화 매체			B27, GlutaMAX 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Neurobasal.

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