마우스 뇌에 외상성 뇌 손상 전달

초록

출처: Zhong, J., et al. 이광자 현미경을 사용한 폐쇄형 두개골 외상성 뇌 손상 및 두개골 창이 있는 마우스에서 형광 단백질 발현의 생체 내 이미징. J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 마우스의 외상성 뇌 손상(TBI)을 보여줍니다. 두개골을 노출시킨 후 TBI 부위를 표시합니다. 그런 다음 마우스가 TBI 장치 아래에 위치합니다. 충격은 금속 막대를 들어 올려 두개골과 접촉하는 임팩터에 자유롭게 떨어뜨릴 수 있도록 함으로써 전달됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 반복적 외상성 뇌 손상(TBI) 유도 투여

참고: TBI 매개변수는 TBI 영향이 한 번 전달된 이전 보고서에서 조정되었습니다. 여기서 프로토콜은 총 영향 수를 10으로 늘리는 것을 제외하고 동일한 매개 변수를 적용합니다.

1. TBI 장비
   1. 주문 제작된 휴대용 장치를 사용하여 그림 1B와 같이 오른쪽의 마우스 헤드에 닫힌 두개골 TBI(그림 1A)를 관리합니다.
2. 수술 전 준비 사항
   1. 일반 가위, 수술용 캘리퍼스, 수술용 스프링 가위, 수술용 겸자, 모기 집게, 헤드포스트 조각, 거즈 및 면 팁 애플리케이터를 포함한 오토클레이브 수술 장비.
   2. 수술 2시간 전에 마우스의 체중을 측정하고 기록합니다. 두개골 창 이식 중 뇌부종을 최소화하기 위해 인슐린 주사기를 사용하여 덱사메타손 인산나트륨을 4.8mg/kg[2mg/mL, 보통 ~70μl(두 부위에 주입해야 함)]의 용량으로 대퇴사두근에 주입합니다. 덱사메타손 주사 후 TBI 수술을 시작하기 전에 나중에 사용할 수 있도록 2.1단계에 표시된 대로 유리창을 준비합니다.
   3. 수술 스테이지 및 TBI 장비를 75% 에탄올을 사용하여 소독합니다. 입체성 플랫폼에서 수술 단계를 덮기 위해 일회용 멸균 수술 드레이프를 확장합니다. 난방 장치와 온도 모니터를 켜고 목표 온도를 37 °C로 설정합니다.
   4. 산소 탱크 밸브를 열고 산소 유량을 1.5L/min으로 조정합니다. 마취기를 열고 이소플루란 수치를 3.
      로 설정합니다. 참고: 100% 순수 산소는 동물이 TBI 영향에서 살아남는 데 도움이 될 수 있습니다.
   5. 마우스를 유도실에 넣고 완전한 마취가 완료될 때까지 5분 동안 그대로 두십시오.
   6. 마우스가 완전히 마취되면(즉, 꼬리 핀치 반사가 없는 경우 2초당 약 1주기로 느리지만 꾸준한 호흡 속도) 유도 챔버에서 마우스를 제거하고 마우스 머리를 입위 프레임에 놓습니다.
   7. 마취 튜브 노즈콘을 마우스의 주둥이에 놓습니다.
   8. 100% 순수 산소와 혼합된 1.5% 이소플루란을 1L/min 유속으로 사용하여 수술이 끝날 때까지 마취를 유지합니다. 주기적으로 호흡 빈도를 확인하고 수술 내내 최소 15분마다 꼬리 또는 발가락 꼬집기를 제공하여 적절한 마취를 평가합니다. 원하는 마취 깊이를 유지하기 위해 이소플루란 농도를 적절하게 조정합니다.
3. TBI 수술
   1. 일회용 인슐린 주사기를 사용하여 부프레노르핀(1mg/kg, 피하)을 투여하고 마우스의 눈에 안과 연고를 바릅니다.
   2. 가위로 정수리의 머리카락을 잘라 1 다음 1 분 동안 제모제를 도포하여 제거합니다.
      주의: 제모제 제품은 피부 자극을 유발할 수 있으므로 두피에 3분 이상 바르지 마십시오. 또한 제모제가 쥐의 눈에 들어가지 않도록 하십시오.
   3. 거즈와 면봉 어플리케이터를 바르고 두피 피부를 청소합니다. 그런 다음 75% 에탄올을 먼저 사용한 다음 베타딘을 사용하여 피부를 소독합니다. 이것을 세 번 반복하고(즉, 에탄올 다음에 베타딘을 투여) 베타딘을 피부에 마지막으로 바르십시오.
   4. 마우스가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 마취 깊이를 다시 확인합니다(즉, 꼬리 꼬집음 반사가 없는 것과 함께 2초당 약 1주기로 느리지만 꾸준한 호흡 속도). 수술용 겸자 3로 피부를 덮고 눈에서 약 3mm 후방에서 시작하여 12-15mm 길이의 정중선을 절개합니다.
   5. 스프링 가위 2를 사용하여 두개골의 왼쪽과 오른쪽 반구의 피부를 절제합니다.
   6. 두개골이 드러나면 멸균된 솜 끝이 있는 어플리케이터로 부드럽게 문지르고 멸균 식염수로 씻어내어 골막을 제거합니다.
   7. 두개골의 상태를 육안으로 검사하여 이전 바이러스 주입 수술을 위해 만들어진 두 개의 작은 구멍을 제외하고는 두개골이 손상되지 않았는지 확인합니다.
   8. 두개골 부위를 건조시키고 TBI 충격 부위를 Bregma에서 뒤쪽으로 2.5mm, 시상 봉합사에서 오른쪽으로 측면으로 2mm 좌표로 표시합니다(그림 1B).
   9. 입체 프레임에서 마우스를 빠르게 제거하고 TBI 장치 아래의 버퍼 쿠션에 헤드를 놓습니다.
   10. 임팩터 팁을 표시된 충격 부위에 맞춥니다.
   11. 밧줄로 묶인 나일론 끈을 마우스 머리 위로 15cm 당겨 금속 기둥을 들어 올린 다음 풀어서 TBI 사이트의 두개골 상단과 접촉하는 변환기 막대에 무게가 자유롭게 떨어지도록 합니다. TBI 충격을 전달할 때 마우스 머리를 만지지 마십시오.
   12. 마우스를 가열 담요 위로 옮기고 등을 대고 눕히면서 호흡 상태를 모니터링합니다.
   13. 마우스가 누운 자세에서 엎드린 자세로 몸을 움직이면 1.5L/min 유속으로 3% 이소플루란과 100% 순수 산소를 혼합하여 5~5분 동안 이소플루란 유도 챔버에 놓습니다.
   14. 마우스가 완전히 진정되면(즉, 꼬리 핀치 반사가 없는 경우 2초당 약 1주기로 느리지만 꾸준한 호흡 속도) 1.3.9-1.3.14단계를 반복하여 총 10번의 충격을 얻습니다.
       참고: 본 연구에서 10개의 TBI 영향이 낮은 마우스 사망률로 강력한 표현형을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다(데이터는 아직 발표되지 않음). 매개변수는 충격의 횟수 및/또는 무게가 방출되는 높이를 늘리거나 줄임으로써 뇌 손상의 다른 심각도를 달성하기 위해 조정될 수 있습니다. 모든 매개변수는 현지 IACUC의 승인을 받아야 합니다.
   15. 외과용 현미경으로 두개골을 확인하고 두개골 골절이 발생한 경우 연구에서 마우스를 제거합니다.
   16. 가짜 수술의 경우, 동물을 충격기 아래에 놓는 것을 포함하여 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 따르되 TBI 충격을 전달하지 마십시오.
   17. 10번째 TBI 충격 후 마우스가 누운 자세에서 엎드린 자세로 이동한 후 이소플루란 유도 챔버에 ~5분 동안 놓습니다. 그런 다음 1.2.6-1.2.8 단계에 따라 아래에 설명된 두개골 창 이식 수술을 위해 마우스 머리를 입체 프레임에 놓습니다.

결과

그림 1: TBI 장치, TBI 영향 부위 및 창 준비에 대한 다이어그램. (A) 중량 강하 TBI 장치용 장비. 1: 받침대, 2: 브래킷, 3: 조정 가능한 클램프, 4: 나일론 스트링, 5: 중량 낙하 터널, 6: 금속 중량 기둥(50g), 7: 임팩터, 8: 버퍼 쿠션. (B) 바이러스 주입 및 TBI 충격 부위의 개략도, 좌표는 브레그마 뒤쪽 2.5mm, 시상 봉합선에서 오른쪽 측면 2mm입니다. (C) 유리창을 준비하기 위한 개략도. 3mm 및 5mm 직경의 두 개의 유리 커버 슬립이 광학 접착제를 사용하여 결합됩니다. (D) 금속 헤드 포스트 및 이미징 우물의 사진.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
조정 가능한 정밀 어플리케이터 브러시	파켈	S379
BD 인슐린 주사기	BD (영어)	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16 인치 x 31G
베타딘	퍼듀	NDC67618-151-17	포비돈 요오드 7.5% 포함
부프레노르핀	PAR 제약	표준편차 42023-179-05
에토날	피셔 사이언티픽	04355223EA	75%
난방 장치	증권 시세	TC-1000 마우스	입체 기구를 장착하여 수술 중 사용
난방 담요	CVS 약국	E12107	여분의 가열 장치 및 수술 후 사용
윤활제 안연고	피케탈	재질 보기 NDC 46066-753-55
마커 펜	델라스코	SMP-BK
모기 집게	캐롤라이나	상품 #:625314	스테인리스 스틸, 곡선형, 5인치
제모제	맥케슨 코퍼레이션	해당 사항 없음	Nair 헤어 알로에 & 라놀린 제모 로션
일반 가위 1	유로스탯(Eurostat)	유로스타트 ES5-300
일반 가위 2	세계적인 정밀 기기	번호 501759-G
생리	바이오월드	L19102411PR
봄 가위 1	세계적인 정밀 기기	번호 91500-09	팁 스트레이트
봄 가위 2	세계적인 정밀 기기	번호 91501-09	팁 스트레이트
Stereotaxic 플랫폼	코프	모델 900LS
수술용 겸자 1	전자 현미경 과학	캣로그# 0508-5/45-PO	스타일 5/45, 곡선
수술 겸자 2	전자 현미경 과학	catlog# 0103-5-PO	스타일 5, 스트레이트
외과 겸자 3	전자 현미경 과학	캣로그# 72912
수술 겸자 4	전자 현미경 과학	캣로그# 0508-5/45-PO	스타일 5/45, 곡선
수술용 램프	라이카	라이카 KL300 LED
Vetbond 티슈 접착제	3M 동물 보호	부품 번호:014006

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