방법 논문

Fluorescence Immunostaining of Rat Hippocampal Neurons within a Microfluidic Chip

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Nagendran, T., et al., 1차 쥐 뉴런을 구획화하기 위한 사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩의 사용. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 신경 세포의 성숙과 연결성을 분석하기 위해 미세유체 칩 내에서 배양된 쥐 해마 뉴런의 면역형광 염색을 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 칩 내 형광 면역 염색

  1. PBS에 4% 포름알데히드 고정 용액을 준비합니다(4% 포름알데히드, 1μM MgCl2, 0.1μm CaCl2, 120mM 자당).
  2. 칩의 웰에 있는 대부분의 매체를 제거합니다(내부 구획을 건조하지 마십시오).
  3. 즉시 100μL의 고정 용액을 축삭 및 체세포 구획의 상단 웰에 추가합니다.
  4. 1분 후 바닥 웰에 고정 용액 100μL를 추가합니다. 실온에서 30분 동안 고정합니다.
  5. 칩의 웰에서 대부분의 용액을 제거합니다(내부 구획을 건조하지 마십시오). 즉시 150μL의 PBS를 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 추가합니다. PBS가 하단 웰로 흘러 들어갈 때까지 2분 동안 기다립니다.
  6. 1.5단계를 두 번 반복합니다.
  7. 칩의 웰에서 대부분의 PBS를 제거합니다. 0.25% TritonX-100이 포함된 PBS 150μL를 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 즉시 추가합니다. 15분 동안 기다립니다.
  8. 칩의 웰에서 대부분의 액체를 제거하고 즉시 150μL의 차단 용액(PBS의 경우 10% 일반 염소 혈청)을 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 추가합니다. 15분 동안 기다립니다.
    메모: 효과적인 차단 용액은 2차 항체에 특이적이어야 하며, 예를 들어, 당나귀 항양 2차 항체의 경우 차단 용액에 당나귀 혈청을 사용합니다.
  9. 칩의 웰에서 대부분의 액체를 제거하고 즉시 PBS의 1% 정상 염소 혈청에 100μL의 1차 항체(또는 항체)를 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 추가합니다. 증발을 최소화하기 위해 덮개를 덮고 실온에서 1시간 또는 하룻밤 동안 4°C에서 기다립니다.
  10. 칩의 웰에서 대부분의 용액을 제거합니다(내부 구획을 건조하지 마십시오). 즉시 150μL의 PBS를 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 추가합니다. PBS가 하단 웰로 흘러 들어갈 때까지 5분 동안 기다립니다.
  11. 1.10단계를 두 번 반복합니다.
  12. 칩의 웰에서 대부분의 액체를 제거하고 PBS의 2차 항체(또는 항체) 100μL를 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 즉시 추가합니다. 증발을 최소화하기 위해 덮개를 덮고 실온에서 1시간 동안 기다립니다.
    메모: 2차 항체의 권장 희석에 대해서는 제조업체의 지침을 참조하십시오.
  13. 1.10-1.11단계를 반복합니다.
  14. 면역염색 후 1일 이내에 이미징하는 경우 칩을 PBS로 채우십시오. 이미징 1일 전에 칩을 보관할 경우 증발을 방지하기 위해 칩이 포함된 접시를 파라핀 필름으로 싸서 이미징할 준비가 될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
  15. 시료를 장기간 보관하기 위해 장착 매체(예: Fluoromount-G)를 사용할 수 있습니다.
    1. 칩의 웰에서 대부분의 액체를 제거하십시오. 1mL 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 축삭 및 체세포 구획의 각 상단 웰에 장착 매체 2방울을 추가합니다.
    2. 칩을 기울여 채널을 통한 장착 매체의 흐름을 촉진합니다. 5분 후 하단 웰에 2방울을 떨어뜨립니다. 이미징하기 전에 1시간 동안 기다립니다.
      메모: 장착 매체를 사용한 후에는 다른 대상을 다시 프로브할 수 없습니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자나칩Xona 미세유체공학, LLCXC150150 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
자나칩Xona 미세유체공학, LLCXC450450 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
자나칩Xona 미세유체공학, LLCXC900900 μm 길이의 마이크로그루브 배리어
XC 프리코트Xona 미세유체공학, LLCXC 프리코트XonaChips에 포함됨
소나PDLXona 미세유체공학, LLC소나PDL
Neurobasal 배지써모피셔 사이언티픽21103049
유리 파스퇴르 피펫시그마-알드리치CLS7095D5X 시그마
포름알데히드 16% 관통써모피셔 사이언티픽28906
PBS(10배)써모피셔 사이언티픽QVC0508
노멀 염소 세럼써모피셔 사이언티픽16210064
트리톤 X-100써모피셔 사이언티픽28314
Anti-vGlut1 항체뉴로맙75-066클론 N28/9, 1:100
Alexa Fluor 2차 항체써모피셔 사이언티픽17:40h
스피닝 디스크 컨포칼 이미징 시스템안도르 테크놀로지CSU-X1, 익슨 X3, EMCCD60x 실리콘 오일 & 20x 대물렌즈
시리즈 시리즈 시리즈 년 년

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12Triton X 100PBS

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