쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

초록

출처: Li, H., et al. 쥐 피질 뉴런에서 필라멘트 액틴(F-actin) 푼크타의 정량화. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 현미경 검사를 위해 쥐 피질 뉴런을 형광 염색하는 절차를 보여줍니다. F-액틴 및 수지상 단백질을 표적으로 하여 구조적 무결성을 분석하고 신경 기능과 건강을 연구하는 데 중요한 F-액틴 밀도를 계산합니다.

프로토콜

1. 형광 표지 및 면역세포화학

참고: 1차 피질 세포 배양의 면역형광 라벨링은 1ml의 작업 부피로 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 수행되었습니다.

1. 유리 바닥 접시를 인산염 완충 식염수 pH 7.4(PBS)로 두 번 세척합니다.
2. 실온(RT)에서 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포를 고정합니다.
3. PBS로 세포를 두 번 세척하고 PBS에서 0.1% Triton X-100으로 5분 동안 투과시킵니다.
4. F(필라멘트)-액틴 특이적 염색인 AlexaFluor 488 Phalloidin(1:40, 1ml PBS에 25μl의 Phalloidin)으로 RT에서 20분 동안 세포를 처리합니다.
5. PBS로 세포를 두 번 헹구고 RT에서 1-2시간 동안 10% 일반 염소 혈청으로 차단합니다.
6. PBS의 닭 다클론 항 MAP2(미세소관 관련 단백질 2) 항체(1:2,500)를 2% 정상 염소 혈청으로 희석하고 4 ^0C에서 O/N(밤새)을 배양합니다.
7. 배양 후에는 PBS로 두 번 헹굽니다.
8. 2차 항체(Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG (1:500)를 2% 정상 염소 혈청으로 희석하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
9. PBS로 헹구고 10μl/접시의 Hoescht 염료를 추가합니다.
10. RT에서 3분 동안 배양하고 PBS로 두 번 세척합니다.
    메모: 라벨링된 세포는 이제 2단계(F-actin puncta 계수)를 수행할 준비가 되었습니다.
11. 세포 샘플을 커버슬립제로 100μl의 퇴색 방지 시약으로 보존하고 장기 보관을 위해 어두운 곳에서 4 ⁰°C로 보관합니다.
    메모: Phalloidin은 어둠 속에서 +4°C의 PBS에서 최대 1주일 동안 비교적 안정적이며, antifade coverslipping 시약으로 형광을 보존할 수 있습니다. 그러나 Phalloidin이 장기간 보관되면 확산되기 시작할 수 있으므로 염색 후 1-3일 후에 최적의 이미지를 얻을 수 있습니다.

2. F-actin 푼타 카운팅

1. 형광 현미경을 켜고 20× 대물렌즈로 전환합니다. 현미경 소프트웨어를 열고 1280×960 픽셀 이미지 크기와 0.17 μm/픽셀 이미지 해상도(1× 줌)로 프로그램을 설정합니다.
2. 녹색(495nm) 또는 빨간색(613nm) 형광 채널 아래에서 공동 라벨링된 F-actin/MAP2 뉴런의 이미지를 획득합니다.
3. 명확하게 정의된 수지상 가지(dendritic arbors)가 있는 개별 뉴런의 녹색(F-actin)/빨간색(MAP2) 면역 표지/파란색(Hoescht) 형광 이미지 5개를 선택합니다.
4. 연속 MAP2 면역형광으로 2차 수지상 분절(길이 범위 25-75 μm)에서 F-액틴이 풍부한 구조를 식별합니다.
5. 선택한 이미지 영역을 수평 수준으로 회전합니다. 복사하여 새 이미지로 붙여넣습니다.
6. 각 요리에 대해 일관된 조정을 사용하여 이미지의 배경을 뺍니다.
7. 밝은 녹색의 F-actin puncta를 세고 훈련된 독립적인 관찰자가 선택한 수지상 세그먼트의 길이를 수동으로 추적합니다. 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다.
8. 총 F-actin labeled puncta (N)를 MAP2 labeled dendrites의 길이 (L)로 나누어 밀도를 계산합니다. 데이터를 10μm의 dendrite
   당 F-actin puncta 수로 표현합니다. 메모: 수지상 샤프트의 평균 염색 강도보다 최소 50% 높은 피크 강도를 가진 F-actin 형광의 Puncta(크기 ≤1.5μm)가 선택된 각 수지상 세그먼트에 포함되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 커버 유리	MatTek 코퍼레이션	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 매체	생명 기술	제10565-018
폴리-L-라이신	시그마	P9155
파라포름알데히드	시그마	P6148
AlexaFluor 488 팔로이딘	생명 기술	A12379
노멀 호스 세럼	생명 기술	제26050-070
닭 다클론 항 MAP2	아브캠	AB92434
Alexa Red 594-활용 염소 안티 닭 IgG	생명 기술	A11042
NucBlue 라이브 셀 염색 ReadyProbes 시약 Hoescht 33342	생명 기술	R37605
NIS-Elements 소프트웨어 패키지	Nikon 악기
Nikon Eclipse TE2000-E 도립 형광 컴퓨터 제어 현미경	Nikon 악기

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