쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

초록

출처: Li, H., et al. 쥐 피질 뉴런에서 필라멘트 액틴(F-actin) 푼크타의 정량화. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 현미경 검사를 위해 쥐 피질 뉴런을 형광 염색하는 절차를 보여줍니다. F-액틴 및 수지상 단백질을 표적으로 하여 구조적 무결성을 분석하고 신경 기능과 건강을 연구하는 데 중요한 F-액틴 밀도를 계산합니다.

프로토콜

1. 형광 표지 및 면역세포화학

참고: 1차 피질 세포 배양의 면역형광 라벨링은 1ml의 작업 부피로 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 수행되었습니다.

1. 유리 바닥 접시를 인산염 완충 식염수 pH 7.4(PBS)로 두 번 세척합니다.
2. 실온(RT)에서 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 세포를 고정합니다.
3. PBS로 세포를 두 번 세척하고 PBS에서 0.1% Triton X-100으로 5분 동안 투과시킵니다.
4. F(필라멘트)-액틴 특이적 염색인 AlexaFluor 488 Phalloidin(1:40, 1ml PBS에 25μl의 Phalloidin)으로 RT에서 20분 동안 세포를 처리합니다.
5. PBS로 세포를 두 번 헹구고 RT에서 1-2시간 동안 10% 일반 염소 혈청으로 차단합니다.
6. PBS의 닭 다클론 항 MAP2(미세소관 관련 단백질 2) 항체(1:2,500)를 2% 정상 염소 혈청으로 희석하고 4 ^0C에서 O/N(밤새)을 배양합니다.
7. 배양 후에는 PBS로 두 번 헹굽니다.
8. 2차 항체(Alexa Red 594-conj....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 커버 유리	MatTek 코퍼레이션	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 매체	생명 기술	제10565-018
폴리-L-라이신	시그마	P9155
파라포름알데히드	시그마	P6148
AlexaFluor 488 팔로이딘	생명 기술	A12379
노멀 호스 세럼	생명 기술	제26050-070
닭 다클론 항 MAP2	아브캠	AB92434
Alexa Red 594-활용 염소 안티 닭 IgG	생명 기술	A11042
NucBlue 라이브 셀 염색 ReadyProbes 시약 Hoescht 33342	생명 기술	R37605
NIS-Elements 소프트웨어 패키지	Nikon 악기
Nikon Eclipse TE2000-E 도립 형광 컴퓨터 제어 현미경	Nikon 악기

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