쥐에서 녹내장을 유도하기 위한 고긴장성 식염수 주입 기술

초록

출처: Gossman, C. A. et al. 생체 내 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비에서 녹내장 유도 절차. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 마취된 쥐에서 상공막 정맥에 고긴장성 식염수를 주입하여 녹내장 유도를 보여줍니다. 식염수는 슐렘관을 통해 섬유주 그물망으로 들어가 조직 흉터를 유발하여 수액 유출을 차단하고 안압을 높입니다. 높은 압력은 망막 신경절 세포를 손상시켜 녹내장을 유발합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. 이 연구에서는 생후 3개월령의 수컷과 암컷 쥐를 사용합니다.
2. 동물을 12시간 동안 명암 주기로 유지하고 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다.

2. 동물 마취를 위한 KAX(케타민 + 자일라진 + 아세프로마진) 칵테일 준비

1. 케타민 5ml(100mg/ml)에 자일라진 50mg(20mg/ml)을 아세프로마진(10mg/ml) 1ml와 증류수 3ml와 함께 녹입니다. 철저히 섞는다.
2. 주사기 필터로 살균하고 이 용액을 10ml 세럼 병에 보관하십시오.

3. KAX 주입

1. 동물(g)의 무게를 측정하고 주입할 준비가 될 때까지 케이지로 돌아갑니다.
2. 1ml 인슐린 주사기와 28g 바늘을 사용하여 0.1ml KAX/100g 체중 동물을 복강내로 주입합니다.
3. 동물이 의식을 잃을 때까지 기다립니다. 발과 꼬리를 꼬집어 반사 신경을 확인합니다.
4. 수술 기간 동안 모든 동물을 실험실에 안전하게 보관하십시오.
5. 수술 후에는 동물을 우리로 교체하고 의식을 회복할 때까지 실온(RT)에서 편안하게 지냅니다. 동물이 깨어나 정상적인 행동을 재개할 때만 동물을 동물 시설로 되돌려 보내야 합니다.

4. 수술 및 마이크로니들 조립 준비

1. 멸균 2M NaCl 용액을 만듭니다.
2. 미세 전극 풀러(그림 1C)를 사용하여 0.86mm 내경의 두꺼운 광택 표준 및 얇은 벽의 붕규산 튜브 하나를 미세하게 가늘어진 두 개의 유리 마이크로 니들로 당깁니다(그림 1D, 그림 1E).
3. 이전 단계의 마이크로니들 하나를 되메우기 주사기 바늘과 1ml 주사기를 사용하여 2M 식염수로 다시 채웁니다(그림 1B). 전극 끝에서 기포를 두드립니다.
4. 두 번째 1ml 주사기에 2M NaCl을 채웁니다. 18G 바늘을 연결한 다음 길이(약 10인치)의 폴리에틸렌 튜브를 부착합니다(그림 1A). 주사기 플런저를 사용하여 바늘을 통해 폴리에틸렌 튜브에 식염수를 채웁니다.
5. 마이크로니들과 튜브에 식염수가 모두 채워지면 두 개를 조심스럽게 연결합니다. 그들 사이의 연결부에서 공기를 제거하십시오(그림 2).
6. 마이크로 니들의 끝을 코스 종이 타월의 결에 아주 가볍게 긁어 미세하게 비스
듬히 비스듬히 만듭니다.
7. 종이 타월에 미세한 액체가 보일 때까지 주사기의 플런저를 부드럽게 밀어 마이크로니들의 저항을 확인하십시오. 액체의 흐름은 0.5mm보다 넓지 않아야 합니다.

5. 동물의 준비

1. 각막에 국소 마취제 1 - 2 방울을 바르십시오 (Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP, 0.5%). 안구 반사가 발생하지 않을 때까지 기다리십시오.
2. 가위로 수염을 다듬습니다.
3. 면봉 어플리케이터에 베타딘 용액과 면봉으로 실험용 눈 주위를 적십니다.
4. 현미경을 사용하여 지혈제를 부착하여 아래쪽 눈꺼풀을 고정하여 눈을 부풀리고 상공막 정맥을 노출시키고 안구 움직임을 제한합니다. (그림 3, 화살촉)

6. 녹내장 유발 식염수 주사

1. 마이크로니들 어셈블리와 동물이 준비되면 주사를 시작합니다.
2. 동물이 발/꼬리 꼬집기에 반응하지 않는 것으로 확인되면 정맥에 대해 10도에서 20도 사이의 낮은 각도로 마이크로 니들로 경피 정맥을 조심스럽게 뚫습니다(그림 3, 흰색 화살표). 혈액이 마이크로니들 끝으로 들어갈 때 정맥에 성공적으로 구멍을 뚫는 것이 분명합니다(그림 3, 검은색 화살표).
3. 약 50μl의 식염수를 천천히 수동으로 정맥에 주입합니다. 이 작업은 약 10초 정도 걸립니다. 소금이 혈관 조직을 통해 순환함에 따라 정맥은 하얗게 희어집니다(그림 4, 화살촉). 일부 영역은 핏빛 붉은 모양을 유지할 수 있습니다(그림 4, 화살표).
   1. 완전한 망막 신경절 세포층에 대한 망막 손상이 완전히 보장되도록 첫 번째 주사 부위의 반대쪽 정맥에 두 번째 주사를 수행합니다.
      참고: 몇 분 안에 염분이 혈관계를 통해 순환할 때 눈의 홍채를 통해 뚜렷한 흐린 모습을 볼 수 있습니다.
4. 내부 대조군으로 사용하기 위해 반대쪽 눈을 치료하지 않고 그대로 두십시오.

결과

그림 1. 마이크로니들 부품. (가)식염수 주입에 사용되는 폴리에틸렌 튜브가 있는 주사기. (B) 붕규산 마이크로니들을 되메우는 데 사용되는 백필 주사기. (C) 붕규산 마이크로니들을 만드는 데 사용되는 Narishige 전극 풀러. (D) 전극 풀러에서 당겨지기 전과 후의 붕규산 유리 전극. (E) 당겨진 후 마이크로전극 바늘 끝의 확대된 모습.

그림 2....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자일라진 염산염, 최소 99%	Sigma, 생명과학	X1251-1G
케타민 염산염 주사제, USP, 100mg / ml	퍼트니, Inc	재질 보기 NDC 26637-411-01	10ml 병
아세프로마진 말레산염, 10mg/ml	피닉스 제약, Inc	확인서 57319-447-04, 670008L-03-0408	50ml 병
세럼 병, 10ml	폭스바겐	16171319	붕규산 유리
인슐린 주사기 1ml	폭스바겐	BD329410	28G 바늘
소금	시그마	S7653	2M 용액
Microelectrode 풀러	나리시게 그룹	증권 시세 표시기 - 830
Heavy Polished Standard 및 Thin Walled Borosilicate 튜빙	셔터 기기	B150-86-10마력	필라멘트 없음, 0.86mm
마이크로피펫 주입을 위한 마이크로필 주사기 바늘	월드 정밀 기기, Inc	MF28G
18 게이지 Luer-Lock 바늘	피셔 사이언티픽	1130421	주사기 바늘
유연한 폴리에틸렌 튜브	피셔 사이언티픽	22046941	직경 0.034인치, 약 10인치
프로파라카인 하이드로클로라이드 안과 용액, USP, 0.5%	아콘, Inc	재질 보기 NDC 17478-263-12	15ml 멸균 병
현미경	라이카	스테레오줌 4
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