뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

초록

출처: Upadhyay, A. et al., 뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학적 정제 및 단백질체 특성화. J. Vis. 특급 (2022)

이 비디오는 비아밀로이드 단백질의 밀도 구배 원심분리 및 분해를 사용하여 마우스 뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 원섬유를 분리하는 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 조직 채취 및 아밀로이드 정제

참고: 이상적으로는 아밀로이드 섬유는 새로 절부된 뇌 영역에서 분리되어야 합니다. 그러나 이 방법은 스냅 또는 급속 냉동 뇌 조직에도 잘 작동합니다. 아래는 나중에 사용하기 위해 보관하기 위해 뇌 조직을 스냅 냉동하는 간략한 개요입니다.

1. 뇌 조직 채취 및 보관: 쥐의 뇌를 해부하고 아밀로이드가 많은 영역(즉, 피질 및 해마)을 빠르게 채취한 다음 액체 질소 또는 드라이아이스 알코올 수조에서 급속 동결합니다.
   메모: 스냅 동결은 조직 구성 요소의 구조적 특성을 보존하는 데 도움이 됩니다. 이 쥐는 이소플루란(isoflurane)과 자궁경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 안락사된다. CO₂ 는 뇌 단백질체 무결성을 손상시킬 수 있으므로 사용을 피하는 것이 좋습니다.
2. 해부 후 신선한 조직을 작은 블록(예: 5mm x 5mm)으로 절단하여 보관하면 아밀로이드 추출 전에 보다 효율적인 균질화가 가능합니다. 조직을 멸균 극저온 바이알로 옮기고 캡을 조인 다음 빠르게 담그십시오.
3. 조직을 초저온 조건(예: -80°C 또는 액체 질소)에서 냉동 상태로 보관하십시오. 며칠 후에 추출을 수행해야 하는 경우 조직을 -20°C에서 보관하고 동결 및 해동 주기를 피하십시오. 추출 및 정제 준비가 되면 젖은 얼음에서 얼어붙은 조직을 해동합니다.
   메모: 조직이 액체 질소와 직접 접촉하면 조직 및 단백질 손상이 발생할 수 있습니다. 알코올 수조는 튜브 라벨에서 영구 마커를 제거할 수 있습니다.

2. 나트륨 도데 실 황산염 (SDS) 불용성 물질의 농축

참고: 달리 명시되지 않는 한 4°C에서 얼음 및 원심분리기에 대한 모든 단계를 수행하십시오. 화학 물질 및 기기의 제조업체 및 카탈로그 번호는 재료 표에 나와 있습니다.

1. 6-8개의 세라믹 비드와 갓 준비된 얼음처럼 차가운 균질화 완충액(0.25-1g의 습식 조직 덩어리에 대해 1mL)이 들어 있는 2mL 튜브에 갓 해부하거나 스냅 냉동된 뇌 조직 영역(얼음에서 해동)을 넣는 것으로 시작합니다.
2. 튜브를 비드 밀 균질화기로 옮기고 조직 내용물을 4000rpm으로 분쇄하고 각각 30초의 두 사이클과 그 사이에 30초 간격으로 .
   메모: 대안적으로, 전동 교반기 또는 균질화 시스템을 사용하여 조직을 분쇄하고 균질화할 수 있습니다.
3. 15 mL 튜브에 담긴 1 mL의 뇌 전체 조직 균질화액에 9 mL의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액을 추가하고, 실험실 왁스 필름 스트립으로 밀봉한 다음, 4 °C에서 밤새 종단 간 회전하여 강력한 용해를 보장합니다.
   메모: 원치 않는 큰 세포 파편과 지질을 제거하려면 다음 날 아침에 800 x g에서 4°C에서 10분 동안 튜브를 돌리고 새 튜브에 상층액을 수집합니다. 남은 펠릿을 2mL의 얼음처럼 차가운 균질화 완충액에 재현탁시키고 잘 섞은 다음 4°C에서 10분 동안 다시 회전하고 두 개의 상등액을 결합합니다.
4. 조직 추출물 현탁액에 고체 자당을 최종 농도 1.2M까지 천천히 첨가하고 잘 혼합한 후 4°C에서 45분 동안 250,000 x g에서 원심분리합니다.
5. 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 분쇄에 의해 1.9M 자당을 함유한 2mL의 균질화 완충액에 펠릿을 재현탁한 다음 4°C에서 45분 동안 125,000 x g에서 원심분리합니다.
   메모: 버퍼 부피는 이전 단계에서 회수된 물질의 양에 따라 조정할 수 있습니다. 일반적으로 10 부피의 균질화 완충액(V/V)이 이 단계에 이상적입니다.
6. 피펫을 사용하여 상단 흰색 고체 층을 모아 새 튜브로 옮기고 기포 없이 위아래로 여러 번 피펫팅하여 1mL의 얼음-냉수 세척 버퍼에 용해시킵니다.
7. 최상층 외에도 펠릿은 아밀로이드 원섬유로 풍부합니다. 더 높은 수율을 위해 두 분수를 결합하고 진행하십시오. 피펫을 사용하여 중간 수층을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
8. 결합 된 분획을 8000 x g에서 4 ° C에서 20 분 동안 원심 분리하고 상층액을 폐기합니다.
9. 세척된 펠릿에 1mL의 얼음처럼 차가운 분해 완충액을 추가하고, 재현탁액을 부유시킨 후 실온(RT)에서 3시간 동안 배양합니다.
10. 8000 x g에서 4°C에서 20분 동안 원심분리기를 하고 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
11. 분해된 펠릿을 1mL의 얼음처럼 차가운 Tris 완충액에 재현탁 및 세척(단계 2.8과 동일)합니다.
12. 세척된 펠릿을 위아래로 피펫팅하여 1% SDS 및 1.3M 자당을 함유한 1mL의 가용화 완충액에 재현탁합니다. 200,000 x g에서 4°C에서 60분 동안 빠르게 원심분리기를
    메모: 아밀로이드 피브릴은 세제와 변성제에 대한 내성이 높지만, 세제(1% SDS)에 너무 오래 노출되면 원섬유의 무결성에 영향을 미치거나 단단히 결합된 단백질을 제거하여 후속 분석을 방해할 수 있습니다. 따라서 펠릿을 재현탁 한 직후 원심 분리를 진행하십시오.
13. 펠릿을 저장하고 50mM Tris 완충액(1:0.3 비율)을 추가하여 자당 농도를 1.3에서 1M로 낮추고 4°C에서 45분 동안 200,000 x g에서 한 번 더 원심분리하여 남은 상등액의 부피를 증가시킵니다.
14. 0.5% SDS를 함유한 100μL의 Tris 완충액에 두 펠릿을 용해하고 아밀로이드 정제를 위해 풀링합니다. 눈에 보이는 펠릿은 작으며 불투명하고 회백색으로 보여야 합니다(그림 1A 참조).

결과

그림 1: 아밀로이드 섬유의 생화학적 염색 및 이미징을 사용한 아밀로이드 추출 확인. (A) 농축 아밀로이드 함유 SDS 불용성 펠릿은 불투명한 회백색으로 나타납니다. (B) 0.45μm 니트로셀룰로오스 멤브레인에 블로팅된 정제된 아밀로이드를 함유하는 SDS 용해성 상등액 및 SDS 불용성 펠릿의 콩고 적색 염색; BCA 판독값은 단백질의 로딩 양의 정규화를 위해 사용되었습니다. BCA 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. (C) 콩고 레드 염색 후 SDS 용해성 및 아밀로이드 물질의 명시야 이미지(스케일 바: 100μm). (D) 전자 현미경 (스케일 바 : 100 nm)에서 음성 염색을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로테아제 억제제	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	164535	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
염화칼슘	시그마-알드리치	C1016	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
콜라겐 분해 효소	시그마-알드리치	C0130	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
완전한 프로테아제 억제제 칵테일	시그마-알드리치	11697498001	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
드나세 I	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	EN0521	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
K54 조직 균질화 시스템 모터	콜 파머	글라스-콜 099C	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
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Precellys 24 조직 균질화기	Bertin 악기	P000062-PEVO0-A	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	시그마-알드리치	74255	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
Sorvall Legend Micro 21R 마이크로 원심분리기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	75002446	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다
트리스 - HCl	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15568025	다른 제조업체의 대체 기기, 화학 물질 및 항체를 사용할 수 있습니다

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