뇌실주위 내피 세포의 화학매력 신호에 대한 인터뉴런 반응 평가

초록

출처: Datta, D., et al. 인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 마이그레이션, 화학 인력 및 공동 배양 분석. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 뇌실주위 내피 세포(PVEC)의 화학인력 신호에 대한 반응으로 뉴런 간 이동을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 인터뉴런은 중앙 구획에 배치되며, PVEC와 대조 세포는 양쪽에 있습니다. PVEC로의 이주가 증가하면 화학인력 신호에 대한 긍정적인 반응을 나타냅니다.

프로토콜

1. 화학 인력 분석

1. 멸균 핀셋을 사용하여 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 35mm 접시 중앙에 3웰 배양 삽입물을 놓습니다.
2. 접시를 거꾸로 뒤집습니다. 초미세 팁이 있는 영구적인 검은색 마커를 사용하여 인서트의 중간 구획 주변 경계를 표시합니다.
3. 70μL의 뉴런 배지의 중간 구획에 3 x 10⁴개의 인간 GABAergic interneuron을 시드합니다(그림 1A).
4. 70 μL의 뇌실 주위 내피 세포 배지에 10⁴ 개의 인간 뇌실 주위 내피 세포를 시드하고 10⁴ 개의 제어 내피 세포를 각각 두 개의 외부 구획에있는 70 μL의 제어 내피 세포 배지에 시딩합니다 (그림 1A).
5. 접시 측면을 따라 1mL의 공동 배양 배지(GABA가 없는 50% 심실 주위 유지 배지 및 50% 뉴런 배지)를 추가하여 접시의 코팅이 건조되는 것을 방지합니다.
6. 현미경으로 검사하여 삽입 구획에서 세포가 누출되지 않는지 확인하십시오.
7. 37°C 및 5% CO₂에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 24시간 배양 후 현미경으로 세포가 제대로 부착되었는지, 누출이 없는지 확인합니다.
8. 파종 48시간 후 멸균 핀셋을 사용하여 인서트를 부드럽게 제거합니다. 현미경 아래를 확인하여 세포층이 방해받지 않았는지 확인합니다(0일차).
9. 배지를 제거하고 1mL의 신선한 공동 배양 배지를 추가합니다.
   참고: 0일차 이미지에 필요한 수의 요리를 따로 보관하십시오.
10. 37°C 및 5% CO₂에서 36시간 동안 세포를 배양합니다. 36시간 후 배지를 흡인하고 4% PFA로 세포를 10분 동안 고정하고 1x PBS로 3x 세척합니다.
11. 인간 GABAergic interneuron을 항인간 β-Tubulin 또는 항인간 MAP2 항체로 염색합니다. 염색 절차가 끝나면 각 접시에 1mL의 퇴색 방지 장착 매체를 추가합니다.

2. 이미징 및 데이터 분석

1. 면역 염색 분석 접시를 4X 배율로 현미경 아래에 놓습니다.
2. 시야에서 직사각형 경계(위의 5.10단계에서 만든)의 긴 가장자리 하나를 유지합니다. 해당 경계에 인접한 cell-free 공간에 있는 세포의 이미지를 촬영합니다. 사각형 경계선의 오른쪽의 긴 가장자리와 왼쪽의 긴 가장자리를 따라 영상을 수집합니다.
   참고: 사각형을 기준으로 대각선으로 배치된 셀은 짧은 가장자리 또는 긴 가장자리를 시작 표시로 선택할 때 모호하기 때문에 고려되지 않습니다. 또한, 짧은 가장자리를 가로질러 이동하는 세포의 수는 종종 현저히 적고(아마도 짧은 가장자리를 따라 시작하는 세포의 수가 적기 때문일 수 있음) 고려되지 않습니다.
3. ImageJ에서 이미지를 엽니다. ImageJ를 사용하여 각 셀과 경계 표시 사이의 거리를 계산합니다.
4. 세포 개수로 이동을 평가하려면 ImageJ에서 획득한 이미지의 경계로부터 특정 거리를 설정하십시오. 이 거리 내에 있는 셀의 수를 계산합니다. 평균 숫자, 표준 devia 계산
5. 적절한 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의성을 확보해야 합니다.

결과

그림 1: 화학 인력 분석. (A) 화학-유인 분석법의 스키마. 3웰 배양 삽입물을 사용하여 중간(녹색 점선 사각형)에 중간에 뉴런(IN)을 파종하고, 뇌실 주위 내피 세포(PV ECs, 주황색 점선 직사각형)와 대조 내피 세포(EC, 노란색 점선 직사각형)를 양쪽에 파종했습니다. (B) β-Tubulin으로 표지된 인터뉴런의 이미지는 뇌실 주위 내피 세포로 향하는 강력한 이동을 보여주지만 대조 내피 세포로는 이동하지 않습니다. (C) 인터뉴런의 화학-인력 반응의 정량화. 훨씬 더 많은 수의 뉴런이 대조군 내피 세포보다 뇌실 주위 내피 세포로 이동했습니다. 데이터는 평균 ± S.D(n = 5; *p < 0.05, 스튜던트 t-검정)를 나타냅니다. 스케일 바 = 100μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 내피 세포 제어	세포 역학	R1022
Control endothelial Cells 배지 보충제	세포 역학	엠1019
DMEMF/12 매체	써모피셔 사이언티픽	11320033
E6 미디엄	써모피셔 사이언티픽	A1516401
FGF2	써모피셔 사이언티픽	PHG0261
피브로넥틴	써모피셔 사이언티픽	제33016-015
가바	시그마-알드리치	A2129
혈구계	시그마-알드리치	Z359629
인간 GABergic 뉴런	세포 역학	R1013
인간 GABergic 뉴런 기본 매체	세포 역학	M1010
Human GABergic 뉴런 신경 보충제	세포 역학	M1032
라미닌	시그마	엘2020
장착 매체	벡터 연구소	H-1200
폴리-L-오르니틴	시그마	P4957
PBS (PBS)	써모피셔 사이언티픽	14190
VEGF-에이	페프로텍	100-20
VascuLife VEGF 미디엄 컴플리트 키트	라이프라인 셀 기술	LL-0003	제어 인간 내피 세포 배지의 구성 요소
3웰 실리콘 배양 - 인서트	이비디	80369
35mm 접시	코 닝	430165
4% PFA 용액	피셔 사이언티픽	AAJ19943K2
도립 위상차 현미경	자이스	자이스 액시오베르트 40C
형광 현미경	올림푸스	FSX-100
항-human β-Tubulin 항체	바이오레전드	802001
안티-MAP2 항체	뉴로믹스	CH22103