방법 논문

운동 뉴런 용해물에서 표적 단백질-DNA 복합체의 면역침전(Immunoprecipitation of Target Protein-DNA complexes from Motor Neuron Lysate)

717 조회수

⸱

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. 염색질 면역침전-엑소뉴클레아제(ChIP-Exo)를 사용한 마우스 줄기세포 유래 뉴런의 단백질-DNA 상호 작용의 고해상도 매핑. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 표적 단백질 특이적 항체 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 줄기세포 유래 모터 뉴런 용해물에서 표적 단백질과 교차결합된 DNA 단편의 면역침전을 보여줍니다.

프로토콜

참고: 오토클레이브 증류수 및 탈이온수(ddH2O)는 완충액 및 반응 마스터 믹스를 만드는 데 권장됩니다.

1. 세포 채취 및 가교

  1. 마우스 배아 줄기(ES) 세포를 유사분열 후 뉴런으로 분화한 후 수확된 세포에 11% 포름알데히드를 최종 농도 1%(v/v)로 추가합니다. 실온(RT, 25°C)에서 15분 동안 흔들 플랫폼(로커, 셰이커 또는 회전기)의 암석 세포.
    메모: 가교결합할 대상 단백질에 따라 포름알데히드 가교가 적거나(예: 최종 농도 0.5%) 디숙시미딜 글루타레이트(DSG)와 이중 가교를 사용할 수 있습니다.
  2. 최종 농도 150mM에 2.5M 글리신을 첨가하여 가교 반응을 중지합니다. RT에서 흔들리는 플랫폼에 있는 암석 세포, 5분 동안.
  3. 15mL 코니컬 튜브의 가교 세포를 RT에서 1,350 x g에서 6분 동안 원심분리합니다. 용액을 흡인한 다음 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 세포를 재현탁합니다.
    메모: 가교결합된 세포 펠릿은 액체 질소로 급속 동결한 후 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

2. 세포 용해

참고: 이 프로토콜의 다음 단계는 마우스 ES 세포와 분화된 약 2 x 107 신경 세포에 대한 것입니다. 열린 세포를 분해하기 위해 다양한 세제를 함유한 용해 완충액이 사용됩니다. 사용 직전 50mL의 완충액에 50μL의 1000x 완전 프로테아제 억제제(CPI) 스톡을 첨가합니다.

  1. 표 1에 설명된 대로 용해 완충액 1-3을 준비합니다.
  2. 가교결합된 세포 펠릿을 얼음 위에서 해동한 다음 15mL 원뿔형 튜브에 3mL의 용해 완충액 1에 세포 펠릿을 완전히 재현탁합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 흔들 플랫폼에서 흔들립니다. 1,350 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
  3. 펠릿화된 세포를 3mL의 lysis buffer 2에 완전히 재현탁합니다. 4°C에서 10분 동안 흔들 플랫폼에서 흔들립니다. 1,350 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
  4. 각 펠릿에 1mL의 용해 버퍼 3을 첨가한 다음 얼음에 보관하십시오. 즉시 초음파 처리를 진행하십시오.

3. 염색질 초음파 처리

참고: 이 초음파 처리 절차 중에 샘플을 얼음 위 또는 4°C에 보관하여 가교 반전을 줄이십시오.

  1. 멸균 주걱을 사용하여 15mL 폴리스티렌 튜브에 0.2mL 눈금 표시까지 초음파 처리 비드(재료 표)를 추가합니다. 건조 반점이 보이지 않을 때까지 600μL의 1x PBS에서 볼텍싱하여 초음파 처리 비드를 세척합니다. 30 x g에서 5초 동안 튜브를 원심분리하고 1x PBS.
    를 흡입합니다. 메모: 폴리스티렌 튜브의 초음파 처리는 폴리 프로필렌 튜브의 초음파 처리보다 효율적입니다. 더 적은 수의 세포 (예 : <106 세포)가 초음파 처리 된 경우 초음파 처리 비드를 추가하지 않고 1.5 mL 폴리스티렌 튜브를 사용하십시오.
  2. 1mL의 용해 버퍼 3(단계 2.4에서)에 핵 용해물을 완전히 재현탁시킨 다음 초음파 처리 비드가 포함된 15mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 폴리스티렌 튜브를 간단히 와류로 만듭니다.
  3. 가교 결합 염색질 DNA를 단편화하려면 30W에서 전력 진폭을 설정하고 초음파 처리 주기를 30초 켜기/30초 끄기로 설정하여 최적화된 주기 수를 위해 4°C에서 핵 용해물을 초음파 처리합니다.
    메모: 각 세포 유형 및 배치에 대한 초음파 처리를 최적화하면 최상의 염색질 면역침전-엑소뉴클레아제(ChIP-exo) 수율을 얻을 수 있습니다. 2 x 107 마우스 신경 세포의 경우, 언급 된 설정에서 20-30 초음파 처리주기는 100-500 bp 범위의 염색질을 단편화합니다.
  4. 초음파 처리가 완료된 후 각 샘플의 모든 상등액(초음파 처리된 용해물)을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 10%의 최종 농도로 각 샘플에 1% 2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올)을 추가합니다. 피펫팅으로 혼합합니다.
  5. 세포 파편을 펠릿화하기 위해 4°C에서 10분 동안 13,500 x g의 시료를 원심분리합니다. 각 시료의 모든 초음파 용해물(상등액)을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  6. 각 샘플에서 30 μL의 초음파 용해물(초음파 용해물의 ~3%)을 취하고 새 1.5mL 튜브에 추가하여 초음파 처리를 확인합니다. 항체 코팅된 비드로 배양할 준비가 될 때까지 나머지 초음파 용해물을 4°C에서 보관하십시오.

4. 초음파 처리 확인

  1. 20mL의 0.5M Tris-HCl(pH 8.0), 2mL의 0.5M 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 2mL, 10% 도데실황산나트륨(SDS) 10mL 및 6mL의 오토클레이브 ddH2O를 첨가하여 2x proteinase K 완충액 6mL를 만듭니다. 이 버퍼에 CPI를 추가하지 마십시오. RT에서 50mL 튜브에 보관하십시오.
  2. 단백질을 제거하여 단백질-DNA 가교결합을 역전시키려면 각 샘플에서 30μL의 초음파 처리된 염색질을 취하고(단계 3.6에서) 166μL의 오토클레이브 ddH2O, 200μL의 2x proteinase K 완충액 및 4μL의 20mg/mL proteinase K를 추가합니다. 샘플을 간단히 와류로 처리한 다음 24 x g에서 1-3시간 동안 65°C에서 배양합니다.
  3. 참고 : 초음파 처리 된 용해물은 하룻밤 동안 65 ° C에서 역 가교 될 수 있습니다.
  4. 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(PCIA: 25:24:1) 및 에탄올 침전법을 사용하여 DNA를 추출합니다.
    주의: PCIA는 독성이 있습니다. 표준 개인 보호 장비(PPE)와 함께 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
    1. 1.5mL 튜브의 각 샘플에 400μL의 PCIA를 추가하고, 와류를 최대 속도로 설정하고 20초 동안 샘플을 소용돌이치십시오. RT에서 6분 동안 18,400 x g에서 원심분리기를 사용합니다. 두 단계가 관찰됩니다. 각 샘플의 상부 수성층(투명상)을 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    2. 1 μL의 10 mg/mL RNase A를 추가합니다. 37 °C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
    3. 각 샘플에 20mg/mL 글리코겐 1μL를 첨가한 다음 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 1mL(-20°C 냉동고에 보관)를 침전시킵니다. 간단히 혼합한 다음 -80 °C 냉동고에서 30분에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 18,400 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기 시료를 추출하고 100% 에탄올을 조심스럽게 붓습니다.
    4. 500μL의 얼음처럼 차가운 70% 에탄올(-20°C 냉동고에 보관)로 펠릿을 세척합니다. 18,400 x g에서 4°C에서 5분간 원심분리기.70% 에탄올을 조심스럽게 붓습니다.
    5. 나머지 에탄올이 증발할 때까지 50°C에서 1.5mL 튜브에 샘플을 배양합니다. 15μL의 오토클레이브 ddH2O 또는 뉴클레아제가 없는 ddH2O에 DNA 펠릿을 재현탁합니다.
    6. 추출된 DNA 샘플을 DNA ladder와 함께 120-180V에서 1.5% 아가로스 겔에 넣고 초음파 처리된 DNA의 크기를 확인합니다.

5. 비드를 이용한 항체 배양

참고: 이 프로토콜의 다음 단계는 마우스 ES 세포와 분화된 약 2 x 107 신경 세포에 대한 것입니다. 비드가 깨져 샘플이 오염되거나 항체의 성능이 저하될 수 있으므로 ChIP-exo 프로토콜 중 어느 시점에서도 마그네틱 비드를 동결 및 해동하지 마십시오.

  1. 세포 용해 및 초음파 처리 후 ChIP에 대한 단백질 G 자성 비드(재료 표)를 준비하고 균질해질 때까지 자성 비드를 혼합한 다음 25μL의 자성 비드를 2mL 단백질 낮은 결합 튜브에 추가합니다.
    참고: 사용되는 마그네틱 비드의 유형은 항체의 종류에 따라 다릅니다.
  2. 1mL의 차단 용액으로 비드를 씻고(표 1) 잘 섞은 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 마그네틱 랙에 있는 동안 상층액이 투명해지면 제거합니다.
  3. 마그네틱 비드에 차단 용액 1mL를 추가합니다. 흔들 플랫폼에서 4 ° C에서 10 분 동안 튜브를 흔듭니다. 짧게 돌린 다음 마그네틱 랙에 튜브를 놓고 상층액을 제거합니다.
  4. 5.3단계를 두 번 더 반복합니다.
  5. 마그네틱 비드에 500μL의 차단 용액을 추가합니다. Isl1(0.04 μg/μL, Table of Materials)에 대해 항체를 간단히 회전시킨 다음 차단 용액에 자성 비드를 포함하는 해당 2 mL 단백질 low bind 튜브에 4 μg의 항체를 추가합니다.
  6. 항체 없이 5.5단계를 반복합니다(즉, ChIP에 대한 항체 없음 대조군).
    메모: 추가할 항체의 양은 항체의 품질과 ChIP에 사용되는 세포의 수를 고려하여 경험적으로 결정할 수 있습니다.
  7. 흔들리는 플랫폼에서 6-24 시간 동안 4 ° C에서 암석 샘플.

6. 염색질 면역침전(ChIP)

  1. 5.8단계에서 항체 코팅된 비드를 1mL의 차단 용액으로 세척합니다. 샘플을 4°C의 흔들 플랫폼에 5분 동안 놓습니다. 상층액을 제거합니다.
  2. 6.1단계를 두 번 더 반복합니다.
  3. 항체 코팅된 비드를 50μL의 차단 용액에 재현탁시킨 다음 새로운 2mL 단백질 low bind tube로 옮깁니다. 각 ChIP 샘플에 대해 초음파 용해물(3.6단계에서 ~1.0mL)을 2mL 단백질 저결합 튜브의 항체 코팅된 비드에 추가합니다.
  4. 각 시료를 4°C에서 하룻밤 동안 흔들리는 플랫폼에서 배양합니다.

7. ChIP 세척

참고: ChIP 세척 중 단백질-DNA 교차결합을 유지하기 위해 샘플을 얼음 위 또는 4°C에 보관하십시오.

  1. 표 10에 설명된 대로 고염 세척 버퍼, LiCl 세척 완충액 및 7.4mM Tris-HCl 완충액(pH 2)을 만듭니다. 4°C에서 50mL 튜브에 보관합니다. 사용 직전에 모든 버퍼에 50μL의 1000x CPI 스톡을 추가합니다.
  2. 2mL 단백질 low bind 튜브에서 샘플을 잠시 회전시켜 캡에서 액체를 수집한 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  3. ChIP 세척의 경우 각 튜브에 1mL의 용해 버퍼 3(4°C)을 추가합니다. 4°C의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플을 간단히 회전시킨 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  4. 각 튜브에 차가운 고염 세척 완충액 1mL를 추가합니다. 4°C의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플을 잠시 회전시킨 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  5. 각 튜브에 1mL의 차가운 LiCl 세척 버퍼를 추가합니다. 4°C의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플을 잠시 회전시킨 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
  6. 각 튜브에 차가운 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 1mL를 추가합니다. 4°C의 흔들 플랫폼에서 5분 동안 혼합합니다. 샘플을 간단히 회전시킨 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫으로 상층액을 제거합니다.
    메모: Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 대신 Tris-EDTA 완충액(pH 8.0)을 사용할 수 있습니다.

표 1: 용해 버퍼 1-3 및 블로킹 버퍼에 대한 레시피. 4°C에서 50mL 튜브에 보관합니다.사용 직전에 모든 버퍼에 50μL의 1000x CPI(완전 단백질 분해효소 억제제) 재고를 추가합니다.

호 분 호 호 개 개 개 호
용해 버퍼 1
시약부피 (mL)[결승전]
1M 헤페스(pH 7.3)2.550 밀리미터.
5M 나클1.4140 밀리미터미터
0.5M EDTA(산도 8.0)0.11 밀리엠
50% 글리세롤1010%
10% 옥틸페놀 에톡실레이트2.50.50%
10 % 2- [4- (2,4,4- 트리메틸 펜탄 -2- 일) 페녹시] 에탄올1.250.25%
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기
용해 버퍼 2
시약부피 (mL)[결승전]
0.5 M 트리스 -HCl (산도 8.0)110 밀리미터미터
5M 나클2200 밀리미터.
0.5M EDTA(산도 8.0)0.11 밀리엠
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기
용해 버퍼 3
시약부피 (mL)[결승전]
1M 트리스-HCl(산도 8.0)0.510 밀리미터미터
5M 나클1100 밀리미터미터
0.5M EDTA(산도 8.0)0.11 밀리엠
10% 데옥시콜산0.50.10%
30% N-라우로일사르코신 나트륨 염 용액0.830.50%
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기
블로킹 솔루션
시약분량[결승전]
소 혈청 알부민(BSA)250의 mg의0.50%
완전 프로테아제 억제제 (CPI, 1000x)50 마이크로L1배
인산염 완충 식염수(PBS)50mL까지 주입

표 2: ChIP 세척 레시피: 고염 세척 완충액, LiCl 세척 완충액 및 10mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4). 4°C에서 50mL 튜브에 보관합니다. 사용 직전에 모든 버퍼에 50μL의 1000x CPI 스톡을 추가합니다.

호 개 개 개 개 개 호 개
고염 세척 버퍼
시약부피 (mL)[결승전]
1M 헤페스(pH 7.3)2.550 밀리미터.
5M 나클5500 밀리미터미터
0.5M EDTA(산도 8.0)0.11 밀리엠
10 % 2- [4- (2,4,4- 트리메틸 펜탄 -2- 일) 페녹시] 에탄올51%
5% 데옥시콜산10.10%
5% SDS10.10%
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기
LiCl 세척 버퍼
시약부피 (mL)[결승전]
0.5 M 트리스 -HCl (산도 8.0)220 밀리미터미터
0.5M EDTA(산도 8.0)0.11 밀리엠
1 M 라이클12.5250 밀리미터미터
10% 옥틸페놀 에톡실레이트2.50.50%
5% 데옥시콜산50.50%
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기
10mM Tris-HCl 버퍼
시약부피 (mL)[결승전]
1M 트리스-HCl(산도 7.4)0.510 밀리미터미터
오토클레이브 ddH2O50까지 채우기

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아가로스, 울트라퓨어인비트로젠16500초음파 처리 확인(섹션 4.3.6)
알부민, 소 혈청(BSA), 프로테아제 프리, 열 충격 차단, 최소 98%바이오샵ALB003차단 솔루션
Isl1에 대한 항체증권 시세39.3F7비드를 사용한 항체 주입(섹션 5.6)
바이오럽터 피코다이아게노드B01060010초음파 크로마틴 (섹션 3.3)
원심분리기 5424 R에펜도르프5404000138염색질 초음파 처리(섹션 3.5), 초음파 처리 확인(섹션 4.3.1, 4.3.3 및 4.3.4)
원심분리기 5804 R에펜도르프22623508세포 수확, 가교 결합 및 동결(섹션 1.3), 세포 용해(섹션 2.2 및 2.3), 염색질 초음파 처리(섹션 3.1)
완전한, 미니, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일로슈4693159001Proteinase K 완충액 및 ChIP 용리 완충액을 제외한 모든 완충액에 첨가
Deoxycholic Acid 나트륨 염피셔 사이언티픽BP349용해 버퍼 3, 고염 세척 버퍼 및 LiCl 세척 버퍼
EDTA, 0.5 m, 멸균 용액, pH 8.0바이오샵EDT111용해 버퍼 1-3, 초음파 처리 확인(섹션 4.1), 고염 세척 버퍼, LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용출 버퍼
에틸 알코올 무수, 100%상업용 알코올P006EAAN초음파 처리 확인(섹션 4.3.3)
포름 알데히드, 36.5-38 %는 10-15 % 메탄올을 함유하고 있습니다.시그마F8775세포 채취, 가교 결합 및 동결(섹션 1.1)
글리세롤, 시약 등급, 최소 99.5%바이오샵글리002용해 버퍼 1
글리신, 생명공학 등급, 최소 99%바이오샵GLN001세포 수확, 가교 결합 및 동결(섹션 1.2)
글리코겐, RNA 등급써모 사이언티픽(Thermo ScientificR0551초음파 처리 확인(섹션 4.3.3)
HEPES, 1m 멸균 여과 용액, pH 7.3바이오샵헵003용해 버퍼 1, 고염 세척 버퍼
염화리튬(LiCl), 시약 등급바이오샵릿704LiCl 워시 버퍼
ChIP용 마그네틱 비드(Dynabeads Protein G)Dynabeads Protein G (ChIP용 마그네틱 비드)Dynabeads Protein G (ChIP용 마그네틱 비드)비드를 이용한 항체 배양(Section 5)
마그네틱 랙(DynaMag-2 자석)인비트로젠12321디섹션의 여러 단계에서 사용됨: 5
N-라우로일사르코신 나트륨염 용액, 30% 수용액, ≥97.0%(HPLC)시그마61747용해 버퍼 3
옥틸페놀 에톡실레이트(IGEPAL CA630)바이오샵논999용해 버퍼 1 및 LiCl 세척 버퍼
페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올, 생명 공학 학년 (25 : 24 : 1)바이오샵PHE512초음파 처리 확인(섹션 4.3.1)
인산염 완충 식염수(PBS), 1x코 닝21040CV세포 수확, 가교 결합 및 동결(섹션 1.3) 및 염색질 초음파 처리(섹션 3.1), 비드를 사용한 항체 주입(섹션 5.1)
PowerPac 기본 전원 공급 장치바이오라드1645050초음파 처리 확인(섹션 4.3.6)
Proteinase K 용액, RNA 등급인비트로젠25530049초음파 처리 확인(섹션 4.2)
Rnase A, Dnase 및 프로테아제 무함유써모 사이언티픽(Thermo ScientificEN0531초음파 처리 확인(섹션 4.3.2)
염화나트륨(NaCl), 바이오시약시그마S5886용해 버퍼 1-3, 고염 세척 버퍼
나트륨 Dodecyl Sulfate (SDS), 전기 영동 등급바이오샵SDS001초음파 처리 (섹션 4.1), 고 염 세척 버퍼 및 ChIP 용리 버퍼 확인
초음파 처리 비드 및 15 mL Bioruptor 튜브다이아게노드C01020031초음파 염색질 (섹션 3.1 및 3.2)
써모믹서 F1.5에펜도르프5384000020섹션 4.2, 4.3.2 및 4.3.5
트리즈마 염산염 용액(Tris-HCl), BioPerformance 인증, 1 m, pH 7.4시그마T219410mM 트리스-HCl 버퍼
트리즈마 염산염 용액(Tris-HCl), BioPerformance 인증, 1 M, pH 8.0시그마T2694용해 버퍼 2, 용해 버퍼 3, 초음파 처리 확인 (섹션 4.1), LiCl 세척 버퍼 및 ChIP 용리 버퍼
VWR 미니 튜브 로커, 가변 속도폭스바겐제10159-752섹션의 여러 단계에서 사용됨: 1, 2, 5, 6 및 7
2-[4-(2,4,4-트리메틸펜탄-2-일)페녹시]에탄올, 트리톤 X-100, 시약 등급바이오샵TRX506용해 버퍼 1, 초음파 처리 크로마틴(섹션 3.4) 및 고염 세척 버퍼
년 표시기 ) 년 ) 시리즈 호 시리즈

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

DNA

관련 논문