소뇌 오가노이드 절편의 형광 면역 염색

초록

출처: Silva, T. P., et al., 인간 만능 줄기 세포에서 성숙한 소뇌 오가노이드의 확장 가능한 생성 및 면역 염색에 의한 특성화. J. Vis. 특급. (2020년)

이 동영상은 오가노이드 성숙을 나타내는 다양한 소뇌 뉴런에서 발현되는 특정 표적 항원을 식별하기 위해 소뇌 오가노이드 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다.

프로토콜

1. 오가노이드 절편의 면역 염색

1. 오가노이드 절편이 포함된 현미경 슬라이드를 예열된 1x PBS 50mL가 들어 있는 코플링 용기에 넣고 최대 10개의 슬라이드를 연속으로 담을 수 있습니다.
   메모: 모든 오가노이드 섹션은 액체에 담가야 합니다.
2. 슬라이드를 젤라틴을 제거하기 위해 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
3. RT에서 5분 동안 50mL의 1× PBS로 1x 세척: 신선한 1×PBS가 들어 있는 코플링 용기에 슬라이드를 옮깁니다.
4. 슬라이드를 갓 준비한 글리신 50mL가 들어 있는 코플링 용기로 옮기고(표 1) RT에서 10분 동안 배양합니다.
5. 슬라이드를 0.1% 트리톤 50mL가 함유된 코플링 용기로 옮기고(표 1) RT에서 10분 동안 투과시킵니다.
6. 1× PBS로 5분 동안 2회 세탁합니다.
7. 3 PBS에 1mm 종이를 적신 1× 면역 염색 접시를 준비합니다. 슬라이스 주위를 티슈로 슬라이드를 말리고 3mm 종이에 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드당 0.5mL의 차단 용액(표 1)으로 슬라이드의 전체 표면을 덮습니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
8. 여분의 차단 용액을 제거하고 슬라이스 주위의 티슈로 슬라이드를 건조시킵니다. 차단 용액에 희석된 1차 항체(표 2) 50μL를 절편 위에 놓고 커버슬립으로 덮습니다. 미리 준비한 면역 염색 접시에 조각을 놓습니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
9. 슬라이드를 TBST 50mL가 담긴 코플링 용기에 옮기고(표 1) 커버슬립을 떨어뜨린 다음 TBST로 5분 3회 세척합니다.
10. 차단 용액에 희석된 2차 항체 50μL를 절편 위에 놓고 커버슬립으로 덮습니다. 미리 준비한 면역 염색 접시에 조각을 놓습니다. RT에서 30분 동안 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
11. 슬라이드를 코플링 용기에 다시 옮기고 TBST 50mL로 5분 3회 세척합니다.
12. 슬라이스 주위의 티슈로 슬라이드를 말리고 미리 준비된 면역 염색 접시에 슬라이스를 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드 전체 표면에 0.5mL의 DAPI 용액을 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
13. 1.9단계를 반복합니다.
14. 티슈로 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오. 슬라이드를 따라 한 방울 한 방울 장착 매체를 추가한 다음 기포를 피하기 위해 약간 구부리면서 각 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 내립니다.

표 1: 동결 절제 및 면역 염색을 위한 오가노이드 준비를 위한 솔루션. 냉동 절편 및 면역 염색을 위한 오가노이드 준비에 사용되는 용액을 준비하는 데 사용되는 모든 구성 요소와 부피가 나열되어 있습니다.

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젤라틴/자당 최종 농도 : 7.5 % / 15 % w / w	1. 멸균 Schott 유리 병에 자당 15g과 젤라틴 7.5g의 무게를 달고 잘 섞습니다 2. PBS 1x를 65°C 로 예열합니다. 3. 예열된 PBS 1x를 최종 무게 100g에 넣고 잘 섞습니다 4. Schott 유리병을 65°C의 가열판에 넣고 젤라틴이 녹을 때까지 흔듭니다 5. 용액이 안정화 될 때까지 37 ° C에서 배양하십시오.
글리신 최종 농도 : 0.1 M	갓 준비한 PBS 1x 50mL에 글리신 0.37g을 추가합니다.
트리톤 솔루션 최종 농도 : 0.1 % w / v	1. 10% Triton X-100 스톡을 준비합니다: PBS 1x 50mL에 Triton X-100 5g 2. Triton X-100 스톡 0.5mL를 PBS 1x 50mL에 첨가합니다.
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05 % w / v 트윈-20	20mL 트리스 1M 30mL NaCl 5M 5mL Tween-20(10% 재고: 50mL 물에 Tween-20 5g) 물을 1L까지 채웁니다.
차단 솔루션	TBST 50mL에 소 태아 혈청(FBS, 최종 농도: 10% v/v) 5mL를 추가합니다.
DAPI 솔루션	10mL의 증류수에 15μL의 DAPI 원액(1mg/mL)을 추가합니다
모위올	1. 글리세롤 6g에 Mowiol 2.4g을 넣고 50°C 의 예열 플레이트에서 1시간 동안 흔듭니다. 2. 증류수 6mL를 넣고 2h 동안 흔듭니다. 3. Tris 200mM(pH 8.5) 12mL를 넣고 10분 동안 흔듭니다. 4. 5,000 × g에서 15 분 동안 원심 분리기5. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.

표 2: 1차 항체. 면역염색에 사용되는 1차 항체, 클론 및 최적화된 희석액이 나열되어 있습니다.

년 년 년 년 년 년 년 년 년 년 년

항체	숙주 종	희석
바흘1	토끼	1/500
칼빈딘	토끼	1/500
맵2	마우스	1/1000
N-캐더린	마우스	1/1000
네스틴	마우스	1/400
올리그2	토끼	1/500
팍스6	토끼	1/400
삭스2	마우스	1/200
미정1	토끼	1/200
TBR2	토끼	1/200
투지1	마우스	1/1000

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3MM 종이	WHA3030861	머 크
BARHL1 항체	HPA004809	Atlas 항체와 관련상품
Anti-Calbindin D-28k 항체	CB28	밀리포어
Anti-MAP2 항체	M4403	시그마
Anti-N-Cadherin 항체	610921	BD 트랜스덕션
NESTIN 항체	MAB1259-SP	R&D
Anti-OLIG2 항체	마브엔50	밀리포어
PAX6 항체	PRB-278P	코밴스
Anti-SOX2 항체	MAB2018	R&D
Anti-TBR1 항체	AB2261	밀리포어
Anti-TBR2 항체	AB183991	아브캠
anti-TUJ1 항체	801213	바이오레전드
커버슬립 24x60mm	631-1575	폭스바겐
다피	10236276001	시그마
소 태아 세럼	A3840001	써모피셔
소 가죽에서 추출한 젤라틴	G9391	시그마
유리 Copling 항아리	94회	써모피셔
글리신	MB014001	(주)엔제이테크
모노티오글리세롤	M6154	시그마
모위올	475904	밀리포어	장착 매체
트리톤 X-100	9002-93-1	시그마
트윈-20	P1379	시그마
SuperFrost 현미경 슬라이드	12372098	써모피셔	접착 현미경 슬라이드

년 (영문)