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1. iPSC / hESC 2D 배양에서 대뇌 오가노이드 생성 (Day 0)
참고: 이 프로토콜은 줄기세포(SC) 유지가 비트로넥틴 또는 겔트렉스 기질이 있는 이종이 없는 줄기세포 유지 배지(SCMM)에서 수행된다고 가정합니다. 대체 고단백 줄기세포 배양 배지를 사용하는 경우, 오가노이드 형성을 시작하기 전에 SC 배양을 SCMM으로 전환한 후 최소 2번의 계대를 거치는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 피더 기반 SC 배양 방법으로 테스트되지 않았습니다.
- 정기적인 SC 유지 관리 방법을 사용하여 배양을 50%-70% 융합으로 가져옵니다. 이는 일반적으로 계대 배양 후 3-4일 후이지만, 배양 방법 및 세포주에 따라 달라질 수 있습니다.
메모: 6웰 플레이트에서 약 2웰이 필요하여 96웰 플레이트의 오가노이드를 생산할 수 있습니다.
- 10X-20X 배율에서 명시야 현미경을 통해 배양물을 검사하여 검출 가능한 분화 없이 건강한 집락 형태를 확인합니다.
- SCMM을 온수 수조에서 37°C로 가져오고 50mM Y-27632(암석 억제제) 50μL 바이알과 2mL의 효소 박리 시약을 실온에서 해동합니다.
- 초저부착(ULA) U-bottom 96 웰 플레이트, 멀티채널 P200 피펫 및 25mL 시약 reservoir를 준비합니다.
- 50mL 코니컬 튜브에 45mL의 SCMM을 부분 표본으로 추출하고 45μL의 50mM Y-27632를 추가합니다. 분쇄하여 철저히 혼합하십시오.
- SC가 포함된 두 개의 웰을 진공 흡입하고 P1000 피펫을 사용하여 각 웰에 1mL의 효소가 없는 분리 시약을 빠르게 첨가합니다. 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 4분 동안 배양합니다.
- 처리된 웰을 진공 흡입하고 P1000 피펫을 사용하여 각 웰에 1mL의 효소 박리 시약을 추가합니다.
- 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 추가로 5분 동안 배양합니다.
- 플레이트를 제거하고 처리된 웰을 검사합니다. 플레이트를 부드럽게 두드려 응집된 세포를 분해합니다. 큰 세포 클러스터가 여전히 보이면 37°C에서 2분 더 플레이트를 배양합니다.클러스터가 더 이상 육안으로 보이지 않을 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 세포가 적절하게 해리되면 각 웰에 1mL의 SCMM을 추가하여 해리 효소를 비활성화합니다. 4mL의 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브에 모으고 세포 계수를 위해 작은 부분 표본을 취합니다.
- 유지보수 플레이트에 남아 있는 처리되지 않은 웰은 37°C 인큐베이터로 되돌립니다.
- 계수하는 동안 300 x g에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 총 세포 수를 결정하고 60,000 cells/mL 현탁액을 달성하는 데 필요한 SCMM + Y-27632 용액의 양을 계산합니다.
- 조심스럽게 진공 흡입하고 상등액을 흡입하고 계산된 부피의 SCMM + Y-27632 용액을 추가합니다. 5mL 피펫으로 5-10회 혼합하여 균일한 세포 현탁액을 보장합니다.
- 세포 현탁액을 시약 저장소로 즉시 옮기고 멀티채널 P200 피펫을 사용하여 ULA U-bottom 96웰 플레이트의 각 웰에 150μL를 피펫팅합니다. 이를 통해 96개의 개별 오가노이드가 생성되며, 각 오가노이드는 초기에 9,000개의 세포로 구성됩니다.
- 플레이트를 150 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 48시간 동안 플레이트를 방해하지 마십시오.
2. 대뇌 오가노이드 유지 (2일차)
- 50mL 코니컬 튜브에 17μL의 50mM Y-27643이 포함된 17mL의 SCMM을 준비합니다. SCMM + Y-27632 용액을 뜨거운 수조에서 37°C로 가열합니다.
- 인큐베이터에서 오가노이드 플레이트를 꺼내 75 μL로 설정된 멀티채널 P200 피펫을 사용하여 첫 번째 줄의 웰 가장자리에서 배지를 천천히 빨아들입니다. 배지가 추출되면 배지를 웰로 빠르게 다시 배출하여 느슨한 세포와 오가노이드를 들어 올립니다. 각 행에 대해 이 작업을 반복합니다.
메모: 이하 "분산"이라고 하는 이 기술은 세포 파편과 오가노이드를 현탁액으로 들어 올립니다. 오가노이드는 우물 바닥으로 빠르게 가라앉는 반면, 더 작은 파편은 현탁 상태로 남아 있어 매체 교체로 제거할 수 있습니다. 이는 배양 중 오가노이드가 세포 파편에 머무르는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
- 모든 웰이 분산된 후 오가노이드가 각 웰의 바닥으로 가라앉았는지 확인하기 위해 15초 동안 기다립니다.
- 멀티채널 P200 피펫을 사용하여 각 웰에서 75μL의 배지를 천천히 조심스럽게 흡입하고 폐기물 저장조로 분주합니다.
메모: 대부분의 사용자는 때때로 정기적인 수유 중에 오가노이드를 흡인합니다. 이는 약 1%의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 충분한 오가노이드가 실험 시점까지 생존할 수 있도록 그에 따라 계획을 세우십시오.
- SCMM + Y-27632 용액을 시약 저장소로 옮기고 멀티채널 P200 파이펫을 사용하여 각 오가노이드 웰에 150μL를 분주합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
3. 대뇌 오가노이드 유지 (3일차)
- 이번에는 Y-27643 없이 17mL의 SCMM을 37°C로 가열합니다.
- 멀티채널 P200 피펫을 100 μL로 설정하고 오가노이드 플레이트의 모든 웰을 분산시킵니다(2.2단계 참조). 오가노이드가 웰 바닥으로 가라앉았는지 확인하기 위해 15초 동안 기다립니다.
- 폐기물 저장소를 준비하고 예열된 SCMM을 소스 저장소로 옮깁니다.
- 각 웰에서 125 μL의 배지를 조심스럽게 흡입하고 멀티채널 P200 파이펫을 사용하여 150 μL의 새 SCMM으로 교체합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
4. 대뇌 오가노이드 유지 (4+일차)
참고: 감염될 때까지 격일로 정기 유지 관리를 수행하십시오.
- 4일차에 피드를 시작하기 전에 신경 유도(NI) 배지를 준비합니다.
- 2 mg/mL 헤파린 분취액 250 μL와 100X N-2 보충제 5 mL 바이알 1개를 해동합니다. 250μL의 헤파린, 5mL의 100X N-2 및 5mL의 100X Minimum Essential Medium-Non-Essential Amino Acids(MEM-NEAA)를 Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12) + GlutaMAX 500mL에 추가합니다. 500mL 필터의 혼합 용액을 멸균 필터로 필터링합니다.
참고: NI를 사용하지 않을 때는 4 °C로 유지하십시오. NI는 새로운 배지를 준비하기 전에 최대 2주 동안 지속됩니다.
- 17 mL의 NI 매체를 37 °C로 가열합니다.
- 멀티채널 P200 피펫을 100 μL로 설정하고 오가노이드 플레이트의 모든 웰을 분산시킵니다(2.2단계 참조). 오가노이드가 웰 바닥으로 가라앉았는지 확인하기 위해 15초 동안 기다립니다.
- 폐기물 저장소를 준비하고 예열된 NI를 소스 저장소로 옮깁니다.
- 각 웰에서 125 μL의 배지를 조심스럽게 흡입하고 멀티채널 P200 파이펫을 사용하여 125 μL의 새 NI로 교체합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5. 지카 바이러스(ZIKV)에 의한 오가노이드 감염 (~24일차)
참고: 약 3주간의 분화 후 오가노이드 내에서 ZIKV 감염에 매우 취약한 큰 신경 상피 구조와 장미가 보일 것입니다.
- Earle의 1X Balanced Salt Solution(EBSS), 1X 인산염 완충 식염수(PBS) 및 NI를 뜨거운 물에 담가 37°C로 가열합니다.
- 1X EBSS에서 알려진 농도의 ZIKV를 표적 감염 다중성(MOI)으로 희석합니다.
메모: 바이러스 용량 반응을 달성하기 위해 다양한 MOI의 적정이 권장됩니다. 이것은 바이러스 균주에 따라 다를 수 있습니다. ATCC VR-1838 및 ATCC VR-1843의 경우 일반적인 MOI 값 범위는 0.1에서 10 사이입니다.
- 단일 채널 P200 피펫을 사용하여 오가노이드 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 제거합니다. P200 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 200μL의 1X PBS를 빠르게 첨가하여 오가노이드를 세척합니다.
- 단일 채널 P200 피펫을 사용하여 오가노이드 웰에서 모든 매체를 조심스럽게 제거합니다. 50μL의 1X EBS 전용(모의 감염) 또는 ZIKV 바이러스 용액을 웰에 빠르게 첨가하고 오가노이드가 완전히 침수되도록 합니다. 연구를 위해 감염될 각 오가노이드에 대해 반복합니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 2시간 동안 놓습니다.
메모: 이 기간 동안 모의 감염된 오가노이드를 배양하면 방해받지 않은 오가노이드에 비해 성장에 큰 영향을 미치지 않습니다.
- 바이러스 배양이 완료되기 약 30분 전에 25mL의 NI를 50mL 원뿔형 튜브에 분취하고 뜨거운 수조에서 37°C까지 가열합니다.
- 바이러스 노출이 완료된 후 각 웰에 대해 200μL의 1X PBS로 오가노이드를 세척하고 오가노이드가 15초 동안 안정화되도록 한 다음 단일 채널 P200 파이펫을 사용하여 1X PBS를 제거합니다.
- 각 웰에 200 μL의 신선한 NI를 추가하고 다시 인큐베이터에 넣습니다.
- 선택 사항: 0일 시점의 경우, 감염 1시간 후 오가노이드를 이미지화할 수 있습니다.
- 분산 방법을 사용하여 격일로 125 μL NI를 교체하여 배양을 계속합니다(4단계 참조). 사용한 미디어와 팁에는 감염성 ZIKV 입자가 포함되어 있으므로 적절하게 폐기하십시오.