이중 염색을 통한 소뇌 뉴런 배양에서 신경 세포 생존력 평가

초록

출처: Jiajia, L., et al. 소뇌 과립 뉴런 배양에서 플루오레세인 디아세테이트-프로피듐 요오드화물 이중 염색을 사용한 뉴런 생존력 평가. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 플루오레세인 디아세테이트(FDA)와 프로피듐 요오드화물(PI)을 사용한 이중 염색을 사용하여 소뇌 과립 뉴런과 신경교세포의 혼합 배양에서 뉴런을 식별하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. FDA-PI 이중 염색 및 소뇌 과립 뉴런(CGN) 배양

1. 10mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 20μL의 FDA 원액(최종 농도: 10μg/mL)과 50μL의 PI 원액(최종 농도: 50μg/mL)을 첨가하여 플루오레세인 디아세테이트-프로피듐 요오드화물(FDA-PI) 작업 용액을 준비합니다. 소용돌이로 섞어 얼음 위에 올려 놓습니다.
   메모: 사용 직전에 FDA-PI 작업 솔루션 작업 솔루션을 새로 준비하십시오.
2. 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트를 꺼냅니다. 얼음 위에 올려 놓으십시오.
3. 배양 배지를 흡입하고 콜드 PBS.
   로 교체하십시오. 메모: 용액 변경은 천천히 신중하게 이루어져야 합니다. 피펫 팁으로 세포를 만지지 마십시오.
4. 저온 PBS를 흡입하고 저온 FDA-PI(12웰 세포 배양 플레이트의 경우 500μL/웰 또는 6웰 세포 배양 플레이트의 경우 1mL/웰)로 교체합니다. 얼음 위에 5분 동안 그대로 둡니다.
5. FDA-PI를 흡입하고 저온 PBS(12웰 세포 배양 플레이트의 경우 100μL/웰 또는 6웰 세포 배양 플레이트의 경우 50μL/웰)를 추가합니다.
   메모: 이미지를 촬영할 때 세포가 건조되지 않도록 해야 합니다.
6. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 통과 대역이 450 - 490nm인 여기 필터를 사용합니다. FDA 및 PI에 대한 형광 방출을 각각 520 및 620 nm에서 검출합니다. 동일한 조건에서 형광 현미경의 위상차 모드를 사용하여 일반 조명에서 이미지를 촬영합니다.
   메모: FDA-PI 후 15분 이내에 이미지를 촬영합니다. 노출 시간은 100-300ms이고 아날로그 게인은 2.8x입니다.

2. 신경 세포 생존 능력 평가

1. FDA-PI 이중 염색의 경우, 그래픽 편집기 소프트웨어에서 PI 양성 레이어에 FDA 양성 레이어를 드래그하여 다른 형광 필터로 필터링한 후 검출된 세포의 이미지를 오버레이합니다.
   1. "레이어" 패널의 "불투명도" 필드에 "50%"를 입력하여 FDA 양성 레이어의 불투명도를 조정합니다. "Layer" 메뉴에서 "Merge Visible" 버튼을 클릭하여 두 레이어를 병합합니다. "Image" 아래의 "Contrast" 필드에 "50"을 입력하여 오버레이 이미지의 대비를 설정합니다. "조정" | "밝기/대비".오버레이 이미지에 FDA 및 PI 이중 양성 셀이 없는지 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 태아 세럼	지브코	10099141	고품질 FBS는 문화에 필수적입니다.
100× 글루타민	지브코	25030081
100× 항생제	지브코	15240062
BME 매체	지브코	21010046
플루오레세인 디아세테이트	시그마	F7378
프로피듐 요오드화물	시그마	P4170
Rabbit Anti-GAP43 항체	아브캠	AB75810
마우스 Anti-GFAP 항체	세포 신호 전달	3670
파스퇴르 피펫	볼락	Z310727	사용하기 전에 팁을 태우십시오.
6웰 세포 배양 플레이트	증권 시세	Z707759	고품질 세포 배양 플레이트는 배양에 필수적입니다.
필터	밀리포어	SLGP033RB
피펫 5ml	엑셀 바이오	CS017-0003
피펫 10 ml	엑셀 바이오	CS017-0004
CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	311
형광 현미경	니콘	티에스
형광 필터 및 방출 큐브	니콘	B-2A, G-2A, UV-2A
사진 소프트웨어	니콘	NIS 요소
그래픽 편집기 softeware	어도비	포토샵 CS
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