Immunostaining을 통한 초파리 뇌의 버섯체 뉴런 시각화

초록

출처: Kelly, S. M., et al. 성체 초파리 멜라노가스터 뇌에서 버섯 몸체 및 광수용체 뉴런의 해부 및 면역형광 염색. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 돌연변이 초파리 뇌의 버섯체에서 표현형 결함을 시각화하기 위한 상세한 면역염색 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 버섯 몸체의 적절한 형태학적, 기능적 발달을 촉진하는 축삭 유도에 관여하는 단백질인 Fas2에 대한 항체를 사용하는 것입니다.

프로토콜

1. 고정 및 면역형광 염색 절차

1. p200 피펫을 사용하여 9웰 접시에서 절개된 뇌를 PTN(0.1M 인산나트륨 완충액 pH 7.2, 0.1% 비이온성 계면활성제)에 희석된 0.5mL의 4% 파라포름알데히드로 채워진 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 동일한 유전자형을 가진 최소 10 - 15개의 뇌를 하나의 마이크로 원심분리기 튜브에 결합할 수 있습니다. 나머지 모든 단계(슬라이드에 뇌를 장착할 때까지)는 0.5ml 미세 원심분리기 튜브에서 완료됩니다.
   주의: 파라포름알데히드(PFA)는 흄 후드에서 처리해야 합니다. PFA 폐기물은 적절하게 저장하고 처리해야 합니다. 유리 앰플에서 구입한 파라포름알데히드의 20%는 마이크로 원심분리기 튜브에 분주되어 필요할 때까지 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 흄 후드 안에서 4% 파라포름알데히드가 함유된 뇌를 실온에서 저속으로 흔들면서 20분 동안 배양합니다.
3. 고정 후 뇌가 중력에 의해 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하도록 합니다.
   메모: 뇌는 때때로 마이크로 원심분리기 튜브의 측면에 달라붙을 수 있습니다. 이런 일이 발생하면 일반적으로 검지와 엄지 손가락 사이의 튜브를 옆으로 돌리거나 벤치의 튜브를 부드럽게 두드려 뇌의 가라앉음을 촉진하는 것이 도움이 됩니다.
4. p1000 피펫을 사용하여 정착액을 제거하고 500μL의 PTN으로 두 번의 "빠른" 세척을 수행하여 세척 사이에 뇌가 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 이 빠른 세척 중에 모든 뇌가 중력에 의해 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하면 PTN을 즉시 새 버퍼로 교체할 수 있습니다. 추가 세탁 시간이 필요하지 않습니다.
   메모: 일반적으로 튜브에 여분의 완충액을 남겨두는 것이 뇌 제거의 위험을 감수하는 것보다 낫습니다. 튜브에서 실수로 뇌가 제거되지 않았는지 확인하기 위해 피펫 팁을 주의 깊게 검사해야 하는 경우가 많습니다. 뇌가 실수로 팁에 피펫으로 삽입된 경우 마이크로 원심분리기 튜브에 다시 분배하고 뇌가 안정될 때까지 기다린 다음 남아 있는 PTN을 계속 제거합니다.
5. 마지막 급속 세척 후 p1000 피펫을 사용하여 500μL의 PTN을 추가하고 로커/너트에서 실온에서 20분 동안 세척하는 등 세 번의 "긴" 세척을 수행합니다. 앞으로의 모든 "긴" 세척은 20분 동안 이루어져야 합니다.
   메모: 고정 뇌는 이러한 세척 후 PTN에서 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.
6. p1000 피펫을 사용하여 마지막 세척을 제거하고 실온에서 0.5mL의 차단 용액[PTN + 5% 일반 염소 혈청(NGS)]을 타고 실온에서 최소 30분 동안 로커 또는 너트에서 뇌를 배양합니다.
   1. 염소 2차 항체는 후속 프로토콜 단계에서 사용됩니다. 다른 종의 2차 항체를 사용하는 경우, 차단 및 항체 용액에 NGS가 아닌 해당 종의 일반 혈청을 사용해야 합니다.
7. p1000 피펫을 사용하여 차단 용액을 제거하고 PTN에 희석된 1차 항체(PTN + 5% NGS + 희석된 1차 항체)를 추가합니다. 1차 항체를 처음 사용하는 경우 해당 항체의 최적 희석은 경험적으로 결정해야 합니다.
   메모: 버섯체 뉴런을 시각화하기 위해 Fas2를 인식하는 항체가 일반적으로 사용됩니다. 이러한 항체는 DSHB(Developmental Studies Hybridoma Bank)에서 항체 1D4로 사용할 수 있으며 PTN + 5% NGS에서 1:20으로 희석해야 합니다.
8. 로커/너트의 1차 항체 용액에서 4 °C에서 2 - 3 박 동안 뇌를 배양합니다.
9. 1차 항체로 배양한 후 뇌가 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하도록 한 다음 1차 항체 용액을 제거합니다.
10. p1000 피펫을 사용하여 위의 1.4단계 및 1.5단계에서 설명한 대로 0.5mL의 PTN으로 2회의 "빠른" 세척과 3회의 "긴" 20분 세척을 수행하여 각 세척 사이에 뇌가 중력에 의해 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 정착할 수 있도록 합니다.
11. 적절한 형광 표지된 2차 항체로 실온에서 3시간 동안 뇌를 배양합니다. 2차 항체는 일반적으로 1:200.
    의 농도로 0.5mL의 PTN + 5% NGS에 희석됩니다. 메모: 일단 형광 2차 항체가 추가되면, 뇌는 실험의 나머지 기간 동안 어둠 속에 보관되어야 한다.
12. 2차 항체 배양 후 뇌가 미세 원심분리기 튜브의 바닥에 정착하도록 하고 2차 항체 용액을 제거합니다.
13. 위의 1.4단계 및 1.5단계에서 설명한 대로 PTN으로 2회 "빠른" 세척 3회와 20분 "긴" 세척을 수행하여 각 세척 사이에 뇌가 마이크로 원심분리기 튜브 바닥에 조심스럽게 정착하도록 합니다.
14. 세 번째 "긴" 20분 세척 후 p200 피펫을 사용하여 버퍼를 최대한 많이 제거합니다.
15. 75μL의 형광 퇴색 방지 장착 매체를 뇌에 추가합니다. 피펫 브레인과 장착 매체를 피펫 팁에 한 번 장착하여 혼합합니다. 뇌가 미세 원심분리기 튜브의 캡이나 측면에 끼일 수 있으므로 튜브를 뒤집지 마십시오.
    메모: 장착 매체에서 뇌를 현탁시킨 후 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 형광단 담금질을 늦추고 4°C에서 밤새 보관할 수 있습니다. 필요한 경우 뇌를 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있지만 가능한 한 빨리 슬라이드에 장착하는 것이 이상적입니다.

2. 성인 D. melanogaster 뇌를 현미경 슬라이드 및 이미징에 장착

1. "브리지" 슬라이드를 만듭니다. 양전하를 띤 슬라이드에 두 개의 "베이스" 커버슬립을 약 1cm 간격으로 배치합니다. 슬라이드의 양전하를 띤 면이 위를 향하도록 하십시오. 그림 1A와 같이 손톱 광택제로 커버슬립을 슬라이드에 부착합니다. 각 베이스 커버 슬립의 세 바깥쪽 가장자리를 손톱 광택제로 밀봉하면 일반적으로 장착 미디어가 이러한 베이스 커버슬립 아래로 심지어지지 않도록 하는 데 도움이 됩니다. 계속하기 전에 손톱 광택을 완전히 말리십시오(10 - 15분).
2. 슬라이드를 실체현미경 아래에 놓고 절개된 뇌가 포함된 장착 매체 용액을 두 커버슬립 사이의 공간에 피펫팅합니다. 더 많은 대비를 제공하려면 구즈넥 조명을 벤치 탑과 평행이 되도록 조작하는 것이 도움이 됩니다.
3. 피펫을 사용하여 슬라이드에서 추가 장착 매체를 제거하고 슬라이드에서 브레인을 피펫으로 분리하지 않도록 주의하십시오.
4. 여분의 장착 미디어를 제거합니다. 이렇게 하면 다음 단계에서 뇌를 더 정확하게 배치할 수 있습니다.
5. 한 쌍의 집게와 실체 현미경을 사용하여 더듬이가 위를 향하도록 격자 패턴으로 슬라이드에 뇌를 배치합니다.
6. 뇌 위에 커버 슬립("브리지")을 놓습니다(그림 1A). 손톱 광택제를 사용하여 "베이스" 커버 슬립과 접촉하는 브리지 커버 슬립의 측면을 밀봉합니다.
7. p200 피펫을 사용하여 브리지 아래의 중앙 캐비티에 새 장착 매체를 천천히 채웁니다(그림 1B). 중앙 커버슬립의 열린 가장자리에 한 번에 한 방울씩 떨어뜨리고 장착 미디어가 중앙 브리지 커버슬립 아래로 심지가 가도록 합니다. 전체 캐비티가 장착 매체로 채워질 때까지 계속한 다음 투명한 손톱 광택제로 상단과 하단을 밀봉합니다.
8. 손톱 광택제가 마르면 즉시 슬라이드를 이미지화하거나 -20°C의 차광이 가능한 단단한 슬라이드 상자에 보관하십시오.
9. 일주일 이내에 여기 레이저와 선택한 형광 2차 항체에 적합한 필터 큐브가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 뇌를 이미지화합니다. 버섯체 뉴런의 Z-stack 이미지는 일반적으로 20X 또는 40X 대물렌즈를 사용하여 얻을 수 있습니다.

결과

그림 1. 면역형광 이미징을 준비하기 위해 뇌를 장착합니다. (A) 뇌는 뇌가 평평해지는 것을 방지하기 위해 브리지 커버가 있는 SuperFrost Plus 슬라이드에 장착됩니다. 투명한 손톱 광택제가 있는 SuperFrost Plus 양전하 슬라이드에 두 개의 "베이스" 커버 슬립을 부착하고 그 사이에 절개된 뇌를 놓습니다. 투명한 "브리지" 커버 슬립을 뇌 위에 놓고 기본 커버 슬립에 부착합니다. (B) 손톱 광택제가 마르면 Vectashield를 다리 아래에 천천히 피펫으로 넣어 2차 항체의 형광을 보존합니다. 그런 다음 투명 손톱 광택제를 사용하여 "브리지" 커버 슬립의 상단과 하단을 밀봉합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미세해부 겸자/핀셋	테드 펠라	505-뉴멕시코
실가드 요리	리빙 시스템 계측	DD-50-S-BLK(블랙)	amazon.com 에서 사용 가능
Fas2 항체	발달 연구 Hybridoma Bank	1D4
Chaoptin 항체	발달 연구 Hybridoma Bank	24B10
GFP 항체	아베스 랩	GFP-1010
Alexa488 염소 안티 마우스 2차 항체	써모피셔	A-11001
Alexa488 염소 안티 닭 2차 항체	써모피셔	A-11039
Alexa647 염소 안티 마우스 2차 항체	써모피셔	A-21236
파라포름알데히드 20%	전자 현미경 서비스	RT15713
벡타쉴드	벡터 랩스	H-1000
SuperFrost Plus 슬라이드	써모피셔	99-910-01
커버슬립	써모피셔	제12-553-454
Na 인산염 완충액 monobasic	시그마	S3139 (영어
Na 인산염 완충액 이염기성	시그마	S3264 (영어
트리톤 X 100	시그마	X100-100ml
손톱 광택제	전자 현미경 서비스(EMS)	72180
실체현미경	라이카 S6D(KL300 LED 광원
9웰 접시(스폿 플레이트)	폭스바겐	89090-482
너트레이터/로커	어부	22-363-152 또는 88-861-041
35mm 접시	제네시 사이언티픽	32-103
실가드	어부	50-366-794
킴와이프	어부	06-666
잠재적 고정 버퍼
PTN 버퍼			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100은 일반적으로 0.1M NaPhosphate 완충액 0.5L를 구성하고 필요에 따라 한 번에 50ml를 분주
블루밍턴에서 구할 수 있는 플라이 주식
엘라브 (C155)-GAL4		BL458	범신경 GAL4 구동기
w*;;; OK107-갈4		BL 854 (영어	모든 버섯체 뉴런을 위한 GAL4 드라이버(OK107-GAL4 삽입은 4번째 염색체에 있음)
y(1), w(67c23); c739-갈4		BL 7362 (영어	알파 및 베타 엽을 위한 GAL4 드라이버(2번째 염색체)
y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64305 (영문	알파 및 베타 로브용 GAL4 드라이버에는 UAS-CD8-GFP도 포함되어
w*; 201Y-GAL4		BL 4440	주로 버섯 몸체의 감마엽을 위한 GAL4 드라이버(2번째 염색체에서)
y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS- CD8-GFP		BL 64296	버섯 몸체 감마 엽용 GAL4 드라이버, UAS-CD8-GFP도 포함

시리즈 시리즈 호 ) ) 포함) 호 년 합니다. ) ) ) 있습니다.