Inducing Neuroinflammation in Zebrafish Larvae with a Lipopolysaccharide Injection(제브라피시 유충에서 지방다당류 주사로 신경염증 유발)

초록

출처: He, Y. et al. 신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 애벌레 제브라피쉬에 지방 다당류의 뇌실 미세 주입. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 신경 염증을 유발하기 위해 제브라피시 유충의 뇌에 지질다당류(LPS)를 미세 주입하는 방법을 보여줍니다. 유충은 아가로스를 깐 접시에 놓고 바늘을 뇌실에 삽입하고 LPS를 주입합니다. 주입된 LPS는 신경 염증을 유발하는 면역 반응을 유발합니다.

프로토콜

1. 미세주입 준비

1. 유리 모세관 풀링을 위한 5단계 프로토콜(표 1)에 따라 마이크로피펫 풀러(재료 표 참조)를 사용하여 유리 모세관을 당겨 주입을 준비합니다.
2. 바늘 끝(필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세관[3.5인치], 외경[OD] 1.14mm)을 집게를 사용하여 비스듬히 적절한 크기로 엽니다(그림 1A).
3. 거품이 없는지 확인하기 위해 바늘에 0.1mL의 미네랄 오일을 채웁니다.
4. 미세 주입 장치의 강철 바늘의 나사 캡을 제거합니다. 유리 바늘 구멍을 강철 바늘에 맞춘 다음 나사 캡을 조입니다. 로드된 바늘 미세주입 장치를 마이크로매니퓰레이터에 장착합니다(재료표 참조).
5. 마이크로 매니퓰레이터가 현미경 아래에서 장치를 유연하게 이동할 수 있도록 미세 주입 장치의 위치를 조정하십시오. 강철 바늘이 모세관 유리관에 들어가도록 일정량의 파라핀 오일을 배출합니다.
6. 70% 에탄올로 멸균된 유리 슬라이드에 주입 용액(예: 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 5mg/mL LPS)을 떨어뜨리고 팁이 액체 방울에 삽입되도록 미세 주입 장치를 조정합니다. ~2 μL의 주사 용액을 바늘에 넣습니다.
7. 미세 주입 장치의 바늘 끝이 고배율에서 유충과 동일한 시야에 있도록 미세 조작기(위, 아래, 왼쪽 및 오른쪽의 미세 조정 설정)를 설정합니다(그림 1B).

2. 미세 주입을 위한 제브라피시 장착

참고: 제브라피쉬의 뇌 발달은 수정 후 3일(dpf) 이내에 이루어지며 잘 발달된 중추 신경계로 5dpf에서 성숙합니다. 따라서 5 dpf 유충은 이미 LPS 매개 신경 세포 손상과 행동 및 염증 반응을 연구하는 데 적합합니다.

1. 관심 단계에 도달한 후 약 30분 이내에 제브라피시 유충을 주입하여 주입 타이밍의 일관성을 유지합니다.
2. 제브라피쉬 유충을 마취하려면 트리카인을 깨끗한 어항 물(최종 농도 0.02% w/v 트리카인)과 결합하십시오.
3. 전자 레인지를 사용하여 이중 증류수 (ddH₂O)에 2 % 아가로 스 용액을 녹입니다. 녹은 아가로스를 플라스틱 접시에 붓습니다. 2% 아가로스 코팅된 플라스틱 접시는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
4. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 마취된 유충을 2% 아가로스 코팅된 플라스틱 접시의 중앙으로 운반합니다. 바늘에 접근할 수 있도록 뇌 쪽이 위로 향하게 장착된 유충의 방향을 지정합니다.

3. 뇌실 주입

1. 제브라피쉬의 뇌실 구조가 시야에 명확하게 표시되도록 현미경의 배율을 조정합니다(그림 1B).
2. 바늘을 뇌 구조 위에 조심스럽게 놓습니다(그림 1C).
3. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝으로 제브라피시 뇌의 피부를 천천히 찔러줍니다.
4. 풋 페달을 밟아 1x PBS 1nL 또는 다른 농도의 LPS(1.0, 2.5 및 5.0mg/mL)를 배출합니다(재료 표 참조). 뇌실에 1% Evans blue dye(PBS로 희석된) 1nL를 주입한 성공적인 심실 주입 이미지가 예시로 나와 있습니다(그림 1D). 주입 직후 유충을 깨끗한 계란 물(E3) 배지로 옮깁니다. 24시간 후, 현미경 이미징, 기관차 행동 분석 및 기타 지표 측정을 위해 유충을 수집합니다.

결과

표 1: 유리 모세관 당기기를 위한 5단계 프로토콜.

차 호

걸음	작동 시간(초)	열 수준	행동
제1	패>	H80-89	P1L005
T2	1.6-3	H00
T3	패>	H00

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스	시그마-알드리치	A6361
아가로스, 낮은 겔화 온도	시그마-알드리치	A9414
Drummond Nanoject III 프로그래밍 가능한 나노리터 인젝터	드러먼드 사이언티픽	3-000-207
형광 실체 현미경	라이카	M205 FA
대장균 O111:B4에서 추출한 지방다당류	시그마-알드리치	엘3024
수동 micromanipulator	세계적인 정밀 기기	M3301
미네랄 오일	시그마-알드리치	M5904
인산염 완충 식염수	시그마-알드리치	P4417
필라멘트가 있는 얇은 벽 유리 모세관(4인치), OD 1.5mm	세계적인 정밀 기기	TW150F-4
트리카인(3-아미노벤조산, 에틸 에스테르)	시그마-알드리치	A-5040