Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

초록

출처: Laaper, M. et al., 마우스 1차 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 사멸 및 퇴행 모델링.J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 마우스의 1차 소뇌 과립 뉴런에서 ROS(Reactive Oxygen Species)를 사용하여 뉴런 손상 모델을 생성하는 방법을 간략하게 설명합니다. 고농도의 과산화수소를 첨가하여 산화 스트레스를 유발하는 과정을 자세히 설명합니다. ROS 노출은 DNA 가닥 단절과 게놈 불안정성을 유발합니다. 또한 세포 단백질의 산화는 기능을 손상시키고 지질 과산화는 멤브레인 무결성을 손상시킵니다. 이 연쇄 반응은 사이토크롬 c 방출 및 카스파아제 활성화로 이어져 신경 세포 사멸을 초래합니다.

프로토콜

1. 실험적 준비

참고: 다음 원액은 사용할 때까지 준비하고 유지할 수 있습니다.

1. 해부 솔루션
   1. 염화나트륨(NaCl) 3.62g, 염화칼륨(KCl) 0.2g, 인산나트륨(NaH2PO4°_H2O) 0.069g, D-(+)-포도당 1.306g을 증류된 H_2O500mL에 용해시킵니다. 그런 다음 HEPES 완충액 12.5mL, 페놀 적색 용액 450μL 및 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V 20mL를 용액에 추가합니다. 1N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH 7.4로 조정합니다.
   2. 0.22μm 필터로 멸균하고 4°C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최대 1주일에서 10일 동안 안정적으로 유지됩니다.
2. 트립신
   1. 0.9% 염화나트륨에 트립신 25g/L 농도의 원액을 준비합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
3. 트립신 억제제
   1. 닭고기 달걀 흰자 트립신 억제제 1g을 1mM HCl 100mL에 용해시켜 10mg/mL 농도의 스톡을 준비합니다.이 용액은 -20°C에서 보관하십시오.
4. 디옥시리보뉴클레아제(DNase)
   1. 100mg의 DNase 1을 멸균수 10mL에 용해시켜 10mg/mL 스톡을 생성합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
5. 재질 보기 MgSO₄
   1. 6.02g의 황산마그네슘(MgSO₄)을 50mL의 증류수(H₂O)에 첨가하여 1M 스톡을 생성합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
6. 염화칼슘₂
   1. 0.735g의 염화칼슘(CaCl₂∙ 2H₂O)을 증류된 H₂O 50mL에 100mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
7. 케이클
   1. 증류된 H_2O50mL에 KCl 3.7275g을 1M의 저장 농도로 용해합니다.용액을 4°C에서 보관하십시오.
8. D-(+)-포도당
   1. 증류된 H_2O50mL에 D-(+)-포도당 1.802g을 100mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
9. 세포 배양 배지
   1. 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비합니다: 50mL의 소혈 과립 배지를 생성하기 위해 1.125g/L D-포도당이 보충된 45mL의 필터 멸균 Eagle의 최소 필수 배지(E-MEM)에 열 불활성화 투석 소 태아 혈청 5mL, 200mM L-글루타민 500μL, 500mM L-글루타민 100μL, 50mL의 500μL를 추가해야 합니다. 매체는 4°C에서 보관하십시오.
10. 사이토신 beta-D- 아라비노 후라노사이드
    1. 48mg의 시토신 베타-D-아라비노 푸라노사이드를 10mL의 성장 배지에 20mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
11. 폴리-D-라이신
    1. 2 mg/mL 폴리 D-라이신 스톡을 생성하려면 10mL의 멸균 H₂O를 20mg의 폴리 D-라이신에 첨가합니다. 스톡 폴리 D-라이신은 -80 °C에서 100 μL 부분 표본으로 보관해야 합니다.
       메모: 다음 용액은 해부 전에 준비하고 사용할 때까지 4°C로 유지해야 합니다.
12. MgSO₄ 보충 해부 용액
    1. 300 μL의 원액 MgSO₄ - 250 mL의 해부 용액을 추가합니다.
13. 트립신 해부 용액
    1. 100μL의 스톡 트립신과 12μL의 스톡 MgSO₄ - 10mL의 해부 용액을 추가합니다.
14. 트립신 억제제 용액 1
    1. 164 μL의 스톡 트립신 억제제, 250 μL의 스톡 DNase 1 및 12 μL의 스톡 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 추가합니다.
15. 트립신 억제제 용액 2
    1. 1040 μL의 스톡 트립신 억제제, 750 μL의 스톡 DNase 1 및 12 μL의 스톡 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 추가합니다.
16. CaCl₂ 보충 해부 용액
    1. 10 μL의 원료 CaCl₂와 25 μL의 원료 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 첨가합니다.
17. 폴리 D-라이신 코팅 문화 접시
    1. 배양 접시를 코팅하려면 100μL의 스톡 폴리 D-라이신을 40mL의 멸균 H₂O에 희석합니다. 35mm Nunc 배양 접시의 경우 희석된 폴리 D-라이신 용액 2mL를 추가합니다. 4개의 웰 플레이트의 경우 각 웰에 300μL의 희석된 폴리 D-라이신을 추가합니다.
    2. 폴리D-라이신을 1시간 동안 방치한 후 각 웰을 4mL 또는 600μL(각각 35mm 배양 접시 또는 4웰 플레이트용)의 멸균 H₂O로 흡인 및 세척합니다. 그런 다음 H₂O를 흡입하고 접시를 1 시간 동안 자연 건조시킵니다.

2. 뇌 추출 및 소뇌 격리

1. 참수 가위를 사용하여 6-7일 된 새끼 쥐의 목을 베십시오. 멸균 조직 배양 후드에서 뇌 해부를 수행합니다.
2. 뇌를 제거하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 머리를 잡고 그림 1과 같이 현저해부 가위를 사용하여 머리 앞쪽으로 피부를 자릅니다. 그런 다음 오염 위험을 최소화하기 위해 새 가위를 사용하여 두개골 뼈를 자릅니다. 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 두개골을 제거하고 집게나 주걱을 사용하여 뇌를 풀어냅니다.
   1. 필요에 따라 시신경을 잘라 뇌 전체를 쉽게 꺼낼 수 있도록 합니다.
3. MgSO₄가 보충된 해부 용액에 뇌를 넣습니다. 용액과 뇌를 얼음 위에 두십시오.
4. 뇌 제거 후 해부 현미경으로 MgSO₄ 보충 해부 용액에 있는 동안 뇌에서 소뇌를 해부하고 미세한 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 소뇌를 복부 쪽으로 돌리고 맥락막신경총을 확실히 제거합니다.
5. 소뇌를 MgSO₄ 보충 해부 용액 ~1mL가 들어 있는 35mm 접시에 넣습니다.
6. 조직을 작은 조각으로 자르고 30mL의 MgSO₄ 완충 해부 용액이 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다.

3. 마우스 소뇌 과립 뉴런 격리 및 배양

1. 잘게 잘린 뇌 조직이 들어 있는 50mL 튜브를 644 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 상층액을 제거하고 트립신 박리 용액 10mL를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 37°C에서 15분 동안 고속으로 흔듭니다.
3. 트립신 억제제 용액 10 mL를 튜브에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔듭니다.
4. 644 x g 및 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
5. 상층액을 제거하고 트립신 억제제 용액 2 2 mL를 첨가한 후 15 mL 튜브에 옮긴다.
6. 용액이 탁해질 때까지 15mL 튜브의 조직을 분쇄합니다. 그런 다음 5분 동안 그대로 두십시오.
7. 투명한 상층액을 제거하고 상층액을 CaCl₂ 보충 해부 용액 1mL가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.
8. 3.6단계의 펠릿이 들어 있는 튜브의 바닥에 트립신 억제제 용액 2를 더 추가합니다. 다시 분쇄하고 5분 동안 그대로 둡니다. 상층액을 제거하고 3.7단계(즉, 3.6-3.7단계의 반복)에서 상등액이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 대부분의 조직이 기계적으로 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다.
9. 0.3mL의 CaCl₂ 보충 해부 용액을 상층액 1mL당 상층액 수집품에 추가합니다.
10. 튜브의 내용물을 섞은 다음 644 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 상층액을 제거하고 펠릿에 10mL의 새 배지를 추가하고 혼합합니다.
12. 그런 다음 세포를 계수하고 1.5 x 10⁶ cells/mL의 농도로 희석할 수 있습니다. 일반적으로 절개된 각 뇌에서 1,000만 개의 세포가 예상되며, 이는 트립신화 시간과 박리의 효율성에 따라 달라집니다. 이전에 만들어진 폴리 D-라이신 플레이트의 플레이트 셀. 4-well plate의 경우 0.5mL를 plate하여 well당 7.5 x 10⁵개의 세포를 제공합니다. 35mm 접시의 경우 4mL 플레이트를 만들고 플레이트당 6 x 10⁶ 셀을 제공합니다.
13. 24시간 후, 시토신-β-아라비노 푸라노사이드(AraC)를 플레이트에 첨가하여 신경교세포 오염을 줄입니다. 각 배지 mL에 대해 0.5μL의 20mM AraC가 필요합니다. AraC를 추가해도 미디어를 변경할 필요가 없습니다. 세포를 7-8일 동안 유지해야 하는 경우 3일째에 이 치료를 반복합니다.
14. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양액을 유지하고 5일 이후 2일마다 배지 2mL당 배양액에 100μL의 100mM 포도당을 추가합니다. 미디어를 완전히 변경할 필요는 없습니다.

4. 신경 손상 모델링

1. ROS에 의한 세포 사멸(산화 스트레스)을 유도하려면 75-100μM 과산화수소(H₂O₂)로 뉴런을 처리하고 H₂O₂에 5분 동안 노출된 후 병렬 배양에서 조절된 배지로 전환합니다. H2 O_{2 의} 불안정성으로 인해24 시간 처리 후 배양에서 50-70 %의 세포 사멸을 유도하는 수준으로 농도를 최적화하십시오 (그림 2).

결과

그림 1: 쥐의 뇌 제거 및 소뇌 박리.(A) 생후 6-7일 된 쥐의 뇌를 추출하려면 집게를 사용하여 머리를 잡고 현저해부 가위를 사용하여 점선을 따라 앞쪽으로 피부를 자릅니다. 피부와 결합 조직만 절개하도록 주의하며, 너무 깊게 절개하면 두개골에 구멍이 뚫려 뇌가 손상될 수 있습니다. 정중선을 따라 곧게 펴진 세 개의 절개와 옆으로 구부러진 두 개의 절개는 피부를 뒤로 밀어 두개골을 드러낼 수 있도록 합니다. 일단 노출되면 가위 끝으로 두개골을 관통하고 앞쪽으로 자를 수 있습니다. 수막의 식별 및 제거를 용이하게 하기 위해 소뇌가 손상되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 일단 절단된 후, 집게를 사용하여 두개골을 벗겨내고, 뇌를 노출시킨 다음, 한 쌍의 집게나 주걱을 사용하여 시원...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
qPCR 렌티비트럴 적정 키트	증권 시세	#LV900
Speedy 바이러스 정제 솔루션	증권 시세	#LV999
pCMV-dR8.2	애드진	#의 8455
pCMV-VS.VG	애드진	#의 8454
증류수	지브코	#15230162
200mM L-글루타민	지브코	#25030081
35mm Nunc 배양 접시	지브코	#174913
PowerUP SYBR 그린 마스터 믹스	생명 기술	#A25742
BSA V 솔루션	시그마 알드리치	#A-8412
칼슘2 • 2H2O	시그마 알드리치	#C-7902
캄프토테신	시그마 알드리치	#C-9911
닭 달걀 흰자 트립신 억제제	시그마 알드리치	#10109878001
사이토신 beta-D-Arabino Furanoside	시그마 알드리치	#C-1768
D-(+)-포도당	시그마 알드리치	#G-7528
DNase1	시그마 알드리치	#11284932001
독수리 - 최소한의 필수 매체	시그마 알드리치	#M-2279
글리신	시그마 알드리치	#G-5417
열 불활성화 투석 소 태아 혈청	시그마 알드리치	#F-0392
헤페스 버퍼	시그마 알드리치	#H-0887
과산화수소	시그마 알드리치	#216763
50 mg/mL 겐타마이신	시그마 알드리치	#G-1397
마그네슘SO4	시그마 알드리치	#M-2643
N-메틸-D-아스파르트산	시그마 알드리치	#M-3262
페놀 레드 솔루션	시그마 알드리치	#P-0290
트립신	시그마 알드리치	#T-4549
리포펙타민 3000	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	L3000-008
P3000 인핸서 시약	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	L3000-008
Opti-MEM I 리듀스 세럼 미디엄	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985070
케이클	폭스바겐	#CABDH9258
염화나트륨	폭스바겐	#CABDH9286
나H2PO4H2O	폭스바겐	#CABDH9298
폴리 D-라이신	폭스바겐	#의 89134-858
DMEM을 참조하십시오.	들소	#319-005-CL
FBS(증권 시세	들소	#의 080-450

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