Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

1. 실험적 준비

참고: 다음 원액은 사용할 때까지 준비하고 유지할 수 있습니다.

1. 해부 솔루션
   1. 염화나트륨(NaCl) 3.62g, 염화칼륨(KCl) 0.2g, 인산나트륨(NaH2PO4°_H2O) 0.069g, D-(+)-포도당 1.306g을 증류된 H_2O500mL에 용해시킵니다. 그런 다음 HEPES 완충액 12.5mL, 페놀 적색 용액 450μL 및 소 혈청 알부민(BSA) 분획 V 20mL를 용액에 추가합니다. 1N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH 7.4로 조정합니다.
   2. 0.22μm 필터로 멸균하고 4°C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최대 1주일에서 10일 동안 안정적으로 유지됩니다.
2. 트립신
   1. 0.9% 염화나트륨에 트립신 25g/L 농도의 원액을 준비합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
3. 트립신 억제제
   1. 닭고기 달걀 흰자 트립신 억제제 1g을 1mM HCl 100mL에 용해시켜 10mg/mL 농도의 스톡을 준비합니다.이 용액은 -20°C에서 보관하십시오.
4. 디옥시리보뉴클레아제(DNase)
   1. 100mg의 DNase 1을 멸균수 10mL에 용해시켜 10mg/mL 스톡을 생성합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
5. 재질 보기 MgSO₄
   1. 6.02g의 황산마그네슘(MgSO₄)을 50mL의 증류수(H₂O)에 첨가하여 1M 스톡을 생성합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
6. 염화칼슘₂
   1. 0.735g의 염화칼슘(CaCl₂∙ 2H₂O)을 증류된 H₂O 50mL에 100mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
7. 케이클
   1. 증류된 H_2O50mL에 KCl 3.7275g을 1M의 저장 농도로 용해합니다.용액을 4°C에서 보관하십시오.
8. D-(+)-포도당
   1. 증류된 H_2O50mL에 D-(+)-포도당 1.802g을 100mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 4°C에서 보관하십시오.
9. 세포 배양 배지
   1. 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비합니다: 50mL의 소혈 과립 배지를 생성하기 위해 1.125g/L D-포도당이 보충된 45mL의 필터 멸균 Eagle의 최소 필수 배지(E-MEM)에 열 불활성화 투석 소 태아 혈청 5mL, 200mM L-글루타민 500μL, 500mM L-글루타민 100μL, 50mL의 500μL를 추가해야 합니다. 매체는 4°C에서 보관하십시오.
10. 사이토신 beta-D- 아라비노 후라노사이드
    1. 48mg의 시토신 베타-D-아라비노 푸라노사이드를 10mL의 성장 배지에 20mM의 스톡 농도로 용해합니다. 용액을 -20°C에서 보관하십시오.
11. 폴리-D-라이신
    1. 2 mg/mL 폴리 D-라이신 스톡을 생성하려면 10mL의 멸균 H₂O를 20mg의 폴리 D-라이신에 첨가합니다. 스톡 폴리 D-라이신은 -80 °C에서 100 μL 부분 표본으로 보관해야 합니다.
       메모: 다음 용액은 해부 전에 준비하고 사용할 때까지 4°C로 유지해야 합니다.
12. MgSO₄ 보충 해부 용액
    1. 300 μL의 원액 MgSO₄ - 250 mL의 해부 용액을 추가합니다.
13. 트립신 해부 용액
    1. 100μL의 스톡 트립신과 12μL의 스톡 MgSO₄ - 10mL의 해부 용액을 추가합니다.
14. 트립신 억제제 용액 1
    1. 164 μL의 스톡 트립신 억제제, 250 μL의 스톡 DNase 1 및 12 μL의 스톡 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 추가합니다.
15. 트립신 억제제 용액 2
    1. 1040 μL의 스톡 트립신 억제제, 750 μL의 스톡 DNase 1 및 12 μL의 스톡 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 추가합니다.
16. CaCl₂ 보충 해부 용액
    1. 10 μL의 원료 CaCl₂와 25 μL의 원료 MgSO₄ - 10 mL의 해부 용액을 첨가합니다.
17. 폴리 D-라이신 코팅 문화 접시
    1. 배양 접시를 코팅하려면 100μL의 스톡 폴리 D-라이신을 40mL의 멸균 H₂O에 희석합니다. 35mm Nunc 배양 접시의 경우 희석된 폴리 D-라이신 용액 2mL를 추가합니다. 4개의 웰 플레이트의 경우 각 웰에 300μL의 희석된 폴리 D-라이신을 추가합니다.
    2. 폴리D-라이신을 1시간 동안 방치한 후 각 웰을 4mL 또는 600μL(각각 35mm 배양 접시 또는 4웰 플레이트용)의 멸균 H₂O로 흡인 및 세척합니다. 그런 다음 H₂O를 흡입하고 접시를 1 시간 동안 자연 건조시킵니다.

2. 뇌 추출 및 소뇌 격리

1. 참수 가위를 사용하여 6-7일 된 새끼 쥐의 목을 베십시오. 멸균 조직 배양 후드에서 뇌 해부를 수행합니다.
2. 뇌를 제거하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 머리를 잡고 그림 1과 같이 현저해부 가위를 사용하여 머리 앞쪽으로 피부를 자릅니다. 그런 다음 오염 위험을 최소화하기 위해 새 가위를 사용하여 두개골 뼈를 자릅니다. 집게를 사용하여 뇌를 덮고 있는 두개골을 제거하고 집게나 주걱을 사용하여 뇌를 풀어냅니다.
   1. 필요에 따라 시신경을 잘라 뇌 전체를 쉽게 꺼낼 수 있도록 합니다.
3. MgSO₄가 보충된 해부 용액에 뇌를 넣습니다. 용액과 뇌를 얼음 위에 두십시오.
4. 뇌 제거 후 해부 현미경으로 MgSO₄ 보충 해부 용액에 있는 동안 뇌에서 소뇌를 해부하고 미세한 겸자를 사용하여 수막을 제거합니다. 소뇌를 복부 쪽으로 돌리고 맥락막신경총을 확실히 제거합니다.
5. 소뇌를 MgSO₄ 보충 해부 용액 ~1mL가 들어 있는 35mm 접시에 넣습니다.
6. 조직을 작은 조각으로 자르고 30mL의 MgSO₄ 완충 해부 용액이 들어 있는 50mL 튜브로 옮깁니다.

3. 마우스 소뇌 과립 뉴런 격리 및 배양

1. 잘게 잘린 뇌 조직이 들어 있는 50mL 튜브를 644 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 상층액을 제거하고 트립신 박리 용액 10mL를 추가합니다. 그런 다음 튜브를 37°C에서 15분 동안 고속으로 흔듭니다.
3. 트립신 억제제 용액 10 mL를 튜브에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔듭니다.
4. 644 x g 및 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
5. 상층액을 제거하고 트립신 억제제 용액 2 2 mL를 첨가한 후 15 mL 튜브에 옮긴다.
6. 용액이 탁해질 때까지 15mL 튜브의 조직을 분쇄합니다. 그런 다음 5분 동안 그대로 두십시오.
7. 투명한 상층액을 제거하고 상층액을 CaCl₂ 보충 해부 용액 1mL가 들어 있는 새 튜브로 옮깁니다.
8. 3.6단계의 펠릿이 들어 있는 튜브의 바닥에 트립신 억제제 용액 2를 더 추가합니다. 다시 분쇄하고 5분 동안 그대로 둡니다. 상층액을 제거하고 3.7단계(즉, 3.6-3.7단계의 반복)에서 상등액이 들어 있는 튜브에 추가합니다. 대부분의 조직이 기계적으로 해리될 때까지 이 과정을 반복합니다.
9. 0.3mL의 CaCl₂ 보충 해부 용액을 상층액 1mL당 상층액 수집품에 추가합니다.
10. 튜브의 내용물을 섞은 다음 644 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 상층액을 제거하고 펠릿에 10mL의 새 배지를 추가하고 혼합합니다.
12. 그런 다음 세포를 계수하고 1.5 x 10⁶ cells/mL의 농도로 희석할 수 있습니다. 일반적으로 절개된 각 뇌에서 1,000만 개의 세포가 예상되며, 이는 트립신화 시간과 박리의 효율성에 따라 달라집니다. 이전에 만들어진 폴리 D-라이신 플레이트의 플레이트 셀. 4-well plate의 경우 0.5mL를 plate하여 well당 7.5 x 10⁵개의 세포를 제공합니다. 35mm 접시의 경우 4mL 플레이트를 만들고 플레이트당 6 x 10⁶ 셀을 제공합니다.
13. 24시간 후, 시토신-β-아라비노 푸라노사이드(AraC)를 플레이트에 첨가하여 신경교세포 오염을 줄입니다. 각 배지 mL에 대해 0.5μL의 20mM AraC가 필요합니다. AraC를 추가해도 미디어를 변경할 필요가 없습니다. 세포를 7-8일 동안 유지해야 하는 경우 3일째에 이 치료를 반복합니다.
14. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양액을 유지하고 5일 이후 2일마다 배지 2mL당 배양액에 100μL의 100mM 포도당을 추가합니다. 미디어를 완전히 변경할 필요는 없습니다.

4. 신경 손상 모델링

1. ROS에 의한 세포 사멸(산화 스트레스)을 유도하려면 75-100μM 과산화수소(H₂O₂)로 뉴런을 처리하고 H₂O₂에 5분 동안 노출된 후 병렬 배양에서 조절된 배지로 전환합니다. H2 O_{2 의} 불안정성으로 인해24 시간 처리 후 배양에서 50-70 %의 세포 사멸을 유도하는 수준으로 농도를 최적화하십시오 (그림 2).

그림 1: 쥐의 뇌 제거 및 소뇌 박리.(A) 생후 6-7일 된 쥐의 뇌를 추출하려면 집게를 사용하여 머리를 잡고 현저해부 가위를 사용하여 점선을 따라 앞쪽으로 피부를 자릅니다. 피부와 결합 조직만 절개하도록 주의하며, 너무 깊게 절개하면 두개골에 구멍이 뚫려 뇌가 손상될 수 있습니다. 정중선을 따라 곧게 펴진 세 개의 절개와 옆으로 구부러진 두 개의 절개는 피부를 뒤로 밀어 두개골을 드러낼 수 있도록 합니다. 일단 노출되면 가위 끝으로 두개골을 관통하고 앞쪽으로 자를 수 있습니다. 수막의 식별 및 제거를 용이하게 하기 위해 소뇌가 손상되지 않도록 세심한 주의를 기울여야 합니다. 일단 절단된 후, 집게를 사용하여 두개골을 벗겨내고, 뇌를 노출시킨 다음, 한 쌍의 집게나 주걱을 사용하여 시원한 해부 용액으로 추출할 수 있습니다. 뇌를 제거하려면 시신경을 절단해야 할 수도 있습니다. (B) 두개골에서 수막을 제거한 후에는 끝이 가는 집게를 사용하여 소뇌에서 수막을 제거해야 합니다. (C) 끝이 가늘게 뻗은 한 쌍의 집게를 사용하여 소뇌를 남아 있는 조직에서 절개하고 수막이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 검사합니다.

그림 2: 소뇌 과립 뉴런의 뉴런 손상 모델링. 6-7일째 생쥐의 고립된 소뇌는 파트 3에 제시된 절차에 따라 단일 세포로 해리됩니다. 해리 후, 세포를 계수하고 배양 배지 부피에 재현탁시켜 1.5 x 106 cells/mL를 생성합니다.35mm 접시의 경우 4mL를 플레이팅하여 플레이트당 6 x 106 세포를 제공합니다. 이미징 슬라이드의 경우 0.5mL를 플레이팅하여 7.5 x 105 cells/well을 제공합니다. 그런 다음 CGN은 렌티바이러스로 전달되거나 아데노바이러스에 감염될 수 있습니다. 도금 당일(0일 in vitro (DIV))에 아데노바이러스를 사용하면 90% 이상의 transfection 효율을 얻을 수 있으며 산화 스트레스 및 DNA 손상으로 인한 신경 세포 손상을 연구할 수 있습니다. 10μM 캄프토테신(CPT)을 추가하면 DNA 손상이 유발되고 75-100μM 과산화수소(H2O2)가 첨가되면 산화 스트레스가 유발됩니다. H2O2의농도는 24시간 후 50%의 세포 사멸을 유도하도록 최적화되어야 합니다. 5DIV에서 아데노바이러스에 감염되면 transduction efficiency가 10% 미만으로 낮아집니다. NMDA 수용체가 배양에서 풍부할 때 7 DIV에서 뉴런은 100μM NMDA 및 10μM 글리신으로 처리되어 흥분독성을 유도할 수 있습니다. 이는 후속 이미징 분석 또는 단일 뉴런 추적에 이상적입니다. 마지막으로, 0 DIV에서 렌티바이러스로 transductic한 후 7 DIV에서 100 μM NMDA 및 10 μM glycine으로 처리하면 ChIP 염기서열분석, 단백질 발현 검사, live/dead assay 수행을 포함한 배양물의 생화학적 분석이 가능할 만큼 충분히 높은 transduction efficiency(>80%)를 얻을