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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 면역조직화학
- 티미딘 아날로그 염색
- 조직 절편을 PBS(인산염 완충 식염수)에 놓고 양전하를 띤 슬라이드에 5-8 절편을 장착하여 전방에서 후방으로 동일한 방향으로 연속 순서를 유지합니다. 조직 절편이 슬라이드에 완전히 부착되도록 건조시킨 다음 소수성 펜이나 PAP 펜을 사용하여 테두리를 그립니다.
- 투과화 완충액(0.5% TBS(트리스 완충 식염수) -트리톤)으로 절편을 20−30분 동안 투과합니다. 그런 다음 TBS-triton을 사용하여 섹션을 각각 5분 동안 2번 세척합니다.
참고: 투과화는 세포 내 항체 침투를 돕습니다. 투과시간은 조직 두께와 항체 효율에 따라 조절할 수 있습니다. 대안적으로, 하나는 투과화 효능을 증가시키기 위해 세제 농도를 증가시킬 수 있다. 그러나 투과화 시간이 길어질수록 조직의 취약성이 증가하므로 너무 오래 투과되지 않도록 주의해야 합니다.
- 표 1에 따라 Edu(5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 반응액을 준비한다. Alexa488-azide의 최종 농도는 Edu 반응 용액 1mL에서 15μM입니다.
- Edu 반응 용액에서 절편을 30분에서 1시간 동안 배양한 다음 TBS-triton에서 각각 5분 동안 3x 세척합니다. 이 단계가 끝나면 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 이 단계에서 형광 현미경을 사용하여 Edu 반응이 작동하는지 확인합니다. Edu 표지된 세포는 상피 형광 현미경 아래에서 형광을 발합니다.
- 장착된 조직 절편 프로토콜
- 2차 항체, 예를 들어 당나귀 혈청과 동일한 동물에서 배양된 차단 완충액을 사용하여 1.1.4단계의 슬라이드에 장착된 조직 절편을 30분에서 1시간 동안 차단한 다음 TBS-트리톤에서 각각 5분 동안 2x로 세척합니다.
- 차단 단계에서 1:200에서 차단 완충 용액에 1차 항체를 혼합하여 1차 항체(즉, 닭 항네스틴) 용액을 준비합니다. 슬라이드당 250μL는 조직이 용액에 완전히 잠기도록 하기에 충분합니다.
- 세척을 차단한 후 RT에서 하룻밤 동안 1차 항체 용액의 조직 절편을 배양합니다. 사용된 기본 항체에 따라 이 단계를 수정합니다.
메모: 항체의 백그라운드 결합이 높거나 비특이적 결합인 경우 RT(실온) 대신 4°C에서 배양하면 결과가 개선될 수 있습니다. 조직 침투가 좋지 않은 항체는 필요한 경우 2일 동안 배양할 수 있습니다.
- TBS-triton에서 조직 절편을 3회 배양하여 5분 동안 배양하여 과도한 1차 항체를 제거합니다. 그런 다음, 블로킹 버퍼 용액에서 준비된 형광단 접합 2차 항체(예: Alexa 647 anti-chicken at 1:200)에서 RT에서 2시간 동안 조직 절편을 배양합니다.
- TBS-triton에서 조직 절편을 5분 동안 3배 배양하여 과도한 2차 항체를 제거하고 PBS에서 1:100에 RT에서 15분 동안 300μM DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) 용액을 적용합니다.
- PBS에서 5분 동안 조직 절편을 3회 배양하여 과도한 DAPI를 제거하고 면봉이나 섬세한 작업용 물티슈를 사용하여 조직 주변의 팹 펜 서클을 제거합니다. 섹션을 건조시킨 다음 장착 미디어와 커버슬립을 적용합니다. 슬라이드를 이미징하기 전에 장착 미디어를 건조시키십시오.
표 1: 면역조직화학에 활용되는 용액
| 부동액 용액 | 에틸렌-글리콜 150mL + 자당 150g + 500mL 용액의 경우 0.1M PB로 충전 |
| 구연산염 완충액 | 구연산 스톡 9mL + 시트르산 삼나트륨 완충액 41mL + ddH2O450mL |
| 구연산 육수 | [0.1 m] 구연산 21 g/1 L ddH2O |
| 트리소듐시트레이트 스톡 | [0.1 M] 구연산 삼 나트륨 29.4 g / 1 L ddH2O |
| 트리스 완충 식염수 -트리톤 (TBS -Triton) | 0.05% 100x 트리톤(TBS) |
| 투과화 완충액 | 0.5% TBS의 100-x 트리톤 |
| 블로킹 버퍼 | 0.33mL 당나귀 혈청, 10mL TBS-Triton |
| Edu 반응 솔루션 | [0.1M] Tris pH 8.5의 4mL 용액에 1mg의 CuSO4·5H2O를 첨가하여 CuSO4·5H2O 용액을 만듭니다. 그런 다음 조직에 적용하기 전에 CuSO4·5H2O 용액에 600μM Alexa488-아지드 용액 1:40과 L-Na+ 아스코르브산염 10mg/mL를 추가합니다. |