Microglia를 대리 바이오센서로 사용하여 뉴런에서 나노입자 유도 독성 측정

초록

출처: Duffy, C. M. et al., 나노 입자 신경 독성을 결정하기 위한 대리 바이오센서로서의 마이크로아교세포.J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 미세아교세포를 사용하여 나노 입자의 신경독성 효과를 평가하는 방법을 보여줍니다. 나노 입자로 미세아교세포를 활성화하고, 조절된 매체를 필터링하여 미세아교세포 유래 전염증성 사이토카인을 분리하고, 조절된 배지로 시상하부 뉴런 독성을 테스트하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 미세아교세포 배양 유지 관리

1. 따뜻한 세포 배양 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM)에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신/네오마이신(PSN)을 37°C까지 보충했습니다.
2. -80 °C에서 보관하여 18 - 25 번 통로에서 BV2 미세아교세포의 동결 재고를 얻습니다. 37 °C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다.
3. 10ml 세포 배양 배지가 들어 있는 75cm² 벤트 플라스크로 세포를 부드럽게 옮깁니다.
4. 37 ° C에서 5 % CO₂로 플라스크를 배양합니다. 24 시간 후에 배지를 흡입하고 새로운 배지로 교체하십시오. 약 70 - 80% 포화도까지 세포를 성장시킵니다.

2. 셀 계수 및 도금

1. 37°C 수조에서 DMEM과 1x-트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액을 가열합니다.
2. 세포에서 배지를 흡인하고 트립신 500μl를 추가합니다. 37°C에서 2 - 5 분 동안 배양합니다.
3. 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 제거하고 5ml의 DMEM에 현탁합니다. 70μm 여과기를 통해 세포를 50ml 튜브에 세 번 통과시킵니다.
4. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 10% FBS와 1% PSN이 보충된 200μl DMEM의 최종 부피에서 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트에 8,000개의 세포를 시드합니다. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO₂ 플레이트를 배양합니다.
5. 오래된 DMEM을 제거하고 1% PSN이 보충된 200μl의 따뜻한 DMEM으로 교체하여 혈청이 미세아교세포를 굶주리게 합니다. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO₂ 플레이트를 배양합니다.

3. Microglia 활성화

1. 별도의 튜브에서 은 나노 입자(AgNP)(0.01, 0.05 또는 0.1μg/ml) 및 비히클/중성 대조군(구연산나트륨, 0.04mM)을 1% PSN이 보충된 무혈청 DMEM에서 최종 작업 농도로 희석합니다.
2. 각 웰에서 100μl의 매체를 제거하고 100μl의 적절한 처리 화합물로 교체합니다.
3. 37 ° C에서 5 % CO₂에서 24 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

4. 컨디셔닝 미디어 필터링

1. 각 웰에서 200μl의 배지 상등액을 수집하고 수집 튜브(1.5 - 2ml 용량)가 있는 필터(분자량 차단 10kDa)로 옮깁니다.
2. 14,000 x g의 원심분리기, 실온에서 15분간 원심분리기
3. 플로우 스루(입자가 있는 상등액)를 버리고 필터를 새 수집 튜브에 거꾸로 놓습니다.
4. 1,000 x g의 원심분리기, 실온에서 2분간
   메모: 생성된 여과된 배지(분비된 사이토카인 포함)는 6배 농축됩니다.
5. 10% FBS와 1% PSN이 보충된 신선한 DMEM으로 농축액의 부피를 400μl로 만들고 얼음에 보관하십시오.

5. 시상하부 세포 배양 유지

1. 10% FBS 및 1% PSN이 보충된 DMEM 세포 배양 배지를 37°C까지 따뜻하게 합니다.
2. 80°C에서 보관된 18 - 25번 통로에서 시상하부(mHypo-A1/2) 세포의 동결된 재고를 얻습니다. 37°C 수조에서 세포를 빠르게 해동합니다.
3. 10ml 세포 배양 배지가 들어 있는 75cm² 벤트 플라스크로 세포를 부드럽게 옮깁니다.
4. 37 ° C에서 5 % CO₂로 플라스크를 배양합니다. 24 시간 후에 배지를 흡입하고 새로운 배지로 교체하십시오. 대략 70 - 80% 밀도가 될 때까지 세포를 성장시킵니다.

6. 시상하부 세포 독성 측정

1. DMEM 및 1x-트립신-EDTA 용액을 37°C 수조에서 데웁니다.
2. 시상하부 세포에서 배지를 흡인하고 500μl의 트립신을 첨가합니다. 37 °C에서 2 - 5 분 동안 배양합니다. 위의 2단계에서 설명한 대로 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 세포를 제거합니다.
3. 10% FBS와 1% PSN이 보충된 200μl DMEM의 최종 부피에서 검은색 벽의 투명한 바닥 플레이트에서 혈구계와 플레이트 시상하부 세포를 사용하여 5,000개 세포/웰에서 세포를 계수하고 37°C에서 5% CO₂에서 밤새 배양합니다.
4. 멀티채널 피펫터를 사용하여 100μl의 오래된 배지를 제거하고 100μl의 여과된 농축 컨디셔닝 배지를 최종 농도 1x에 추가합니다.
5. 24 시간 동안 37 ° C에서 5 % CO₂ 플레이트를 배양합니다.
6. 22μl의 레사주린 시약을 추가하고 37°C에서 5% CO₂에 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
7. 다중 모드 분광 광도계를 사용하여 형광(560nm EX/590nm EM)을 기록하여 세포 생존율을 측정합니다. 결과를 상대 형광 단위(RFU)로 보고합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포/시약
마우스 미세아교세포주(BV2)	Interlab Cell Line Collection (이탈리아 제노바)	ATL03001
성체 마우스 시상하부 세포주 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc. (셀루션스 바이오시스템즈)	클루172
둘베코의 변형된 독수리의 매체	인비트로젠	10313-039
소 태아 세럼	PAA 연구소	대답15-751
페니실린/스트렙토마이신/네오마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제15640-055
트립신-EDTA	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	25200056
은 나노 입자 (20nm)	시그마-알드리치	730793
PrestoBlue 세포 생존도 시약	인비트로젠	A13262
마우스 TNF-α ELISA Max Delux	바이오레전드	430904
지방다당류	시그마-알드리치	L4391
소듐 시트레이트	시그마-알드리치	S4641
설비
96W 광학 바닥 플레이트, 검은색 폴리스티렌, 세포 배양 처리, 뚜껑 포함, 멸균	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	165305
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 장치(Ultracel-10 멤브레인 포함	EMD 밀리포어	UFC501008
SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트	분자 장치	M5
Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브	코닝, Inc	번호 14-432-22
Falcon 세포 스트레이너 70 μm	코닝, Inc	08-771-2
탁상용 원심분리기 5430	에펜도르프	22620560