신경퇴행을 유도하기 위해 초파리 유충 분절 신경을 기계적으로 손상시키는 것

초록

출처: Danella, E. B., et al. 초파리 운동 뉴런 변성을 연구하기 위한 간단한 신경 기계적 손상 방법론. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 기계적 손상을 통해 초파리 유충 분절 신경에 신경 퇴화를 유도하는 방법을 보여줍니다. 마취된 유충의 복부 표피는 집게를 사용하여 꼬집어 분절 신경에 손상을 입힙니다. 다친 유충은 음식으로 유지되며, 이로 인해 신경의 운동 뉴런이 퇴화되어 신경근 접합부(NMJ)가 파괴

될 수 있습니다.

프로토콜

1. 시약 및 장비 준비

1. 1x 해부 완충액(70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl₂, 20 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₃, 115 mM 수크로스, 5 mM 트레할로스, 5 mM 하이드록시에틸피페라진 에탄 술폰산[HEPES]; pH 7.2)을 준비합니다.
2. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 준비합니다.
3. 0.01% Triton X-100과 함께 1x PBS를 사용하여 1x PBT를 준비합니다.
4. 과일 주스 한천 플레이트를 준비합니다.14 간단히 30g의 한천을 700mL의 H₂O와 오토클레이브에 섞습니다. 메틸 파라벤 0.5g을 에탄올 10mL에 녹이고 과일 주스 농축액(포도 또는 사과) 300mL에 용액을 첨가합니다. 농축액을 오토클레이브 한천 용액에 섞고 10mm x 35mm 페트리 접시의 뚜껑에 붓습니다.
   메모: 포도 한천 파워 프리믹스는 다양한 회사에서 구입할 수도 있습니다 (재료 표 참조).
5. 애벌레를 기계적으로 다치게 할 수 있는 크기 5 집게를 구하십시오.
6. 표준 초파리 CO₂ 기반 마취 장치를 사용하십시오.

2. 초파리 유충 선택

1. 25 °C에서 배양된 방황하는 세 번째 instar 유충이 들어 있는 Drosophila 바이알 또는 병을 가져옵니다.
2. 외모에 따라 10 개의 개별 2 차 또는 3 차 instar 유충을 선택하십시오. 세 번째 instar 유충은 앞쪽 분지 spiracles의 모양으로 식별할 수 있는 반면, 두 번째 instar 유충은 더 작고 더 곤봉 모양의 앞쪽 spiracles를 가지고 있습니다.
   메모: 유충 단계는 타이밍으로도 식별할 수 있습니다. 25°C에서 두 번째 instar 유충은 부화 후 약 48시간 후에 나타나고 세 번째 instar 유충은 약 24시간 후에 탈피합니다. NMJ에서 신경 퇴행을 검사하는 데 관심이 있는 경우 두 번째 instar 유충을 손상시켜야 합니다.

3. 기계적 손상에 대비한 초파리 유충 준비

1. 집게나 붓으로 개별 유충을 조심스럽게 집어 올리고 어떤 식으로든 압축하지 않도록 주의하십시오.
2. 차가운 1X PBS 또는 해부 완충액이 들어 있는 유리 접시에 유충 10마리를 직접 넣어 음식물 찌꺼기를 제거하고 유충의 운동을 늦춥니다.

4. 초파리 유충의 기계적 부상 및 치료

1. 각 개별 유충을 CO₂ 마취 장치에 놓습니다.
2. 해부 현미경으로 각 유충을 등쪽으로 조심스럽게 굴려 큐티클을 통해 분절 신경을 시각화합니다.
3. 위치 크기 5 집게, 입 고리에서 시작하여 유충의 길이에서 약 1/2에서 2/3 정도 아래로 이동합니다. 일단 위치를 잡으면 분절 신경을 포함하는 복부 표피의 약 1/3을 5 크기의 집게로 꼬집습니다.
   1. 유충의 분절 신경이 손상되지 않도록 하려면 분절 신경을 부술 수 있을 만큼 충분한 힘을 가하되 큐티클은 그대로 두십시오. 정확한 힘의 양을 결정하려면 10마리의 유충을 부수고 5시간 후 사망률이 50% 미만인지 확인하십시오.
4. 부상 후 약 0.5g의 효모 페이스트가 들어 있는 과일 주스 한천 플레이트로 유충을 조심스럽게 옮깁니다. 운동성이 방해를 받더라도 계속 먹을 수 있도록 각 유충의 앞쪽 끝이 효모 페이스트에 오도록 각 유충을 배치합니다.
   메모: 유충 분절 신경이 손상되었는지 확인하기 위해 한천 플레이트로 이식된 후 유충 운동성 파괴를 관찰할 수 있습니다. 부상당한 유충은 부상 부위 뒤쪽으로 효과적으로 마비되지만 여전히 입 갈고리를 움직여 먹이를 먹을 수 있습니다. 부상 후 동물의 사망률이 높은 것은 흔한 일이므로 실험에 필요한 것보다 20-50% 더 많은 동물을 다치게 하는 것이 가장 좋습니다.
5. 효모 페이스트와 부상당한 유충 10마리가 들어 있는 한천 플레이트를 빈 100 x 15mm 페트리 접시 바닥에 놓습니다. 이제 부상당한 유충이 들어 있는 이 페트리 플레이트를 젖은 종이 타월로 덮고 종이 타월이 유충이나 한천 플레이트에 닿지 않도록 합니다. 이 페트리 접시를 실온(RT)에서 더 큰 밀폐 용기에 넣습니다.
6. 부상 후 지정된 기간(6, 12 또는 24시간) 후에 해부를 위해 유충을 회수합니다.
   메모: 축삭 세포 골격에 대한 손상의 즉각적인 영향을 조사하기 위해 유충은 손상 직후에 절제 할 수 있습니다. 축삭 수송 결함을 검사하기 위해 유충은 부상 후 약 6시간 후에 절개할 수 있습니다. 손상 후 약 12시간 후에 유비퀴틴화된 단백질의 축적이 관찰될 수 있으며, 손상 후 24시간 후에 NMJ에서 운동 뉴런의 퇴화가 관찰될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
미세 해부 가위	정밀 과학 도구	15000-08
Dumont #3 겸자	정밀 과학 도구	11231-30	어떤 사람들은 사이즈 3을 선호하고 다른 사람들은 사이즈 5를 선호합니다
Dumont #5 집게	정밀 과학 도구	11251-30	어떤 사람들은 사이즈 3을 선호하고 다른 사람들은 사이즈 5를 선호합니다
CO2 에어 탱크	테크 에어	유엔 1013	다양한 크기의 탱크를 구입할 수 있습니다.
CO2 마취 장치	s 제네시 사이언티픽	59-114
스테인리스강 핀, 크기 0.1	정밀 과학 도구	26002-10
SylGard 184 실리콘 엘라스토머, 베이스 및 경화제	다우코닝	3097358-1004	해부 플레이트를 붓기 위해
스테레오 마이크로스코프 해부	암스코프	SM-1BZ
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Thermo Scientific Nalgene 유틸리티 박스	피셔 사이언티픽	03-484씨	유충 회복을 위해 습한 챔버를 만드는 데 사용됩니다

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