마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

Abstract

출처: Tietz, S. M. et al. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. 특급.(2019년)

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. EAE 유도

1. 기화기 시스템을 사용하여 C57BL/6 마우스를 이소플루오란으로 마취합니다. 마우스에서 마취를 유도하려면 마우스를 2.1% 이소플루오란이 있는 안면 마스크로 옮기기 전에 작은 배양실에서 산소 중 4.5% 이소플루오란에 노출시킵니다.마우스의 저체온증을 방지하기 위해 발열 패드가 장착된 마취 장치를 사용하십시오.
2. 마취된 마우스를 한 손에 고정하고 먼저 30μL의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)-펩타이드 aa_35-55(MOG_35-55)를 주입하거나 사타구니 림프절에 근접한 뒷다리 측면(그림 1: 1 + 2, 총 60μL, 왼쪽 측면 30μL 및 오른쪽 측면 30μL)
에 피하로 주입합니다.
3. 마우스를 배에 놓고 꼬리 뿌리의 왼쪽 및 오른쪽 연지방 조직에 20μL의 MOGaa_35-55/CFA 에멀젼을 주입하고(그림 1: 3 + 4, 총 40μL, 왼쪽 꼬리 뿌리 20 μL 및 오른쪽 꼬리 뿌리 20 μL) MOGaa_35-55/CFA 에멀젼의 작은 방울을 마우스의 목에 주입합니다(그림 1: 5).
4. 100μL의 백일해 독소(PTx) 용액을 복강내에 주입합니다. 장으로의 주입을 피하기 위해 마우스의 머리를 신체 중앙 아래로 잡습니다.
5. 유지 보수 식단(압출물 주요 영양소: 조단백질 18.5%; 조지방 4.5%; 조섬유 4.5%; 조회분 6.5%; 전분 35%; 대사 에너지: 13.1 MJ/kg)을 육식 식단(압출물 주요 영양소: 조단백질 23.5%; 조지방 5.5%; 조섬유 3%; 조섬유 5.7%; 전분 36%; 대사 에너지: 14.3 MJ/kg)으로 대체하여 예상되는 임상 질병 전과 기간 동안 생쥐에게 더 높은 에너지 함량의 음식을 제공합니다.
6. 안면 마스크를 제거하고 보온 패드를 사용하여 마우스를 가정용 케이지로 옮깁니다.10분 후 마우스가 완전히 깨어 있고 운동성이 있는지 확인하십시오.
7. 첫 번째 치료 후 48시간 후에 PTx 주입(1.4단계)을 반복합니다.

2. EAE 마우스의 점수 매기기

1. 매일 아침 케이지 내부를 살펴보고 EAE 마우스의 건강 상태를 확인하십시오.
2. 매일 오후 EAE 마우스에 점수를 매깁니다.
3. EAE 실험에 참여한 모든 쥐를 케이지 밖으로 꺼내 손가락으로 꼬리를 위로 움직여 꼬리에 긴장도가 있는지 확인합니다. 건강한 쥐는 꼬리를 위로 유지합니다(꼬리에는 탄력이 있습니다). 임상적 EAE가 시작되면 꼬리 긴장도가 낮아지고 꼬리가 서서히 떨어지는 것을 볼 수 있습니다. 결국 마우스는 꼬리를 전혀 들어 올릴 수 없습니다.
4. EAE 실험에 포함된 모든 개별 쥐를 클린 벤치에 놓고 걷는 행동을 관찰하고 문서화합니다. 질병 중증도 평가를 위한 채점 기준(EAE 점수)은 표 1을 참조하십시오.
5. 실험에 포함된 모든 마우스의 체중을 평가하고 문서화합니다.
6. 임상 EAE 점수가 1인 쥐가 적절한 음식과 수분을 섭취할 수 있도록 케이지 바닥에 있는 플라스틱 접시에 적신 음식을 공급하고 매일 새로 고칩니다.

Results

그림 1: EAE 유도를 위한 주입 부위의 그래픽 표현.1) 오른쪽 측면에 30μL MOG-에멀젼 주입 부위, 2) 왼쪽 측면에 30μL MOG-에멀젼 주입 부위, 3) 왼쪽 꼬리 뿌리에 20μL MOG-에멀젼 주입 부위, 4) 오른쪽 꼬리 뿌리에 30μL MOG-에멀젼 주입 부위, 5) 목으로 MOG-에멀젼의 작은 방울을 위한 주입 부위.

표 1: EAE 질병 중증도 평가를 위한 채점 기준.

0-3 포인트 점수

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
사육 식품	예: PROVIMI KLIBA SA	3336
개별 환기 케이지, 블루 라인 타입 II 또는 III	예: Tecniplast	1145티, 1285엘
암컷 C57BL/6J 마우스 (8-12주)	예) Janvier Labs		암컷, 8-12주
18G x 11/2"(1.2mm x 40mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – 번호 20(0.4mm x 19mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	302200
30G x 1/2"(0.3mm x 13mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	304000
불완전 프로인트 보조제(IFA)	예: 산타크루즈 생명공학	사우스캐롤라이나-24648	4°C에서 보관
유지 보수 식품	예: PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 펩타이드	예) GenScript		-80 °C에서 보관하십시오
결핵균 H37RA	예) BD	231141	4 °C에서 보관하십시오
염화나트륨 0.9 %	B. 브라운	3535789
옴니칸 50 30G x 1/2''	B. 브라운	9151125에스
백일해 독소	예: List Biological Laboratories, Inc.	180	4 °C에서 보관하십시오
스티치 가위	F.S.T	15012-12
주사기 1ml	예: 프리모	62.1002
주사기 10ml	예: CODAN Medical ApS	2022-05