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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 생체 내 투과성 분석
- 솔루션 준비 :
- 덱스트란 원액의 경우, 10 mg의 10 kDa 덱스트란 Alexa Fluor 488과 3 kDa 덱스트란 텍사스 레드를 500 μL의 0.9% 염화나트륨 용액(20 mg/mL)에 용해시킵니다.
- dextran 작업 용액의 경우, 밀봉 필름 조각에 10kDa Dextran Alexa Fluor 488 원액(20mg/mL) 55μL를 주입하기 직전에 3kDa dextran Texas Red 원액(20mg/mL) 55μL를 추가합니다. 100μL를 혼합하여 일회용 미세 주사기(최종 농도 2mg/100μL)에 수집합니다.
- 10% 포름알데히드(파라포름알데히드 또는 PFA) 원액의 경우 깨끗한 유리 비커에 PFA 초순수 분말 10g, PBS 100mL 및 1N 수산화나트륨(NaOH) 200μL를 결합하고 자석 교반기를 사용하여 교반하면서 정확히 56°C로 가열합니다. PFA가 완전히 용해될 때까지 56°C에서 30분 동안 유지합니다. 실온으로 식히고 pH를 7.4로 조정한 다음 종이 필터를 통해 필터링합니다. 20°C에서 보관하십시오. 원액은 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 사용하여 더 희석할 수 있습니다.
- 실험적 자가면역 뇌척수염을 앓고 있는 건강한 C57BL/6 마우스 또는 C57BL/6 마우스 또는 이소플루란이 함유된 EAE를 곧 마취합니다(마우스는 약 1분 동안 진정됩니다). 자동화 시스템을 사용합니다(마우스는 유도 챔버에서 산소 중 4.5% 이소플루란에 노출된 다음 2.1% 이소플루란이 포함된 안면 마스크로 옮겨집니다).
- 마취된 마우스를 테이블의 측면 위치에 놓은 다음 마우스가 깨어나기 전에 100μL의 형광 추적기를 마우스에 정맥 주사(예: 역안와로)합니다.
- 즉시 안면 마스크를 제거하고 짧은 마취 후 마우스가 완전히 깨어 있고 운동성이 있는지 확인하십시오. 추적자를 15분 동안 순환시킵니다.