마우스 두개안면 조직의 면역염색

초록

출처: Yang, J., et al., 마우스 두개안면 조직 및 석회질화되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색. J. Vis. 특급 (2019)

이 동영상은 형광 현미경을 사용하여 핵 마커 발현을 평가하고 세포 증식 및 신호 전달 활성을 측정하여 마우스 배아 두개안면 조직에서 냉동 절편의 면역 형광 염색을 보여줍니다.

프로토콜

면책 조항 텍스트: 동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 면역형광 염색

1. -80 °C에서 슬라이드를 꺼냅니다. 슬라이드를 RT에서 1시간 동안 공기 건조 섹션으로 유지합니다. 0.1% PBST(PBS의 0.1% 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르, 재료 표 참조)로 슬라이드를 각각 5분 동안 3회 헹구어 OCT를 세척하고 단면을 투과시킵니다.
2. 선택적으로 항원 검색(선택 사항)을 수행합니다.
   1. 스티머 또는 수조를 사용하여 염색 접시의 구연산염 완충액(pH 10mM sodium citrate 6)을 95–100°C로 예열합니다. 슬라이드를 구연산염 완충액에 담그고 10분 동안 배양합니다.
   2. 찜기나 수조에서 염색 접시를 꺼내 슬라이드를 실온에서 20분 이상 냉각합니다.15.
      메모: 대안으로, 열 유도 항원 회수를 위해 Tris-EDTA 완충액(10mM Tris 염기, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) 또는 EDTA 완충액(1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0)을 사용하십시오. 뜨거운 찜기 외에도 압력솥, 전자레인지 또는 수조를 사용하여 열 유도 항원 회수를 수행하십시오. 트립신(trypsin) 또는 펩신(pepsin)을 이용한 효소 유도 항원 검색은 또 다른 대안입니다. 효소 회수의 농도와 처리 시간을 최적화하여 단면 손상을 방지합니다. 각 항체/항원 조합에 대한 항원 회수 방법을 최적화합니다.
3. 각 슬라이드에 200μL의 차단 용액(0.1% PBST로 희석된 5% 당나귀 혈청)을 30분 동안 실온에서 배양한 다음 헹구지 않고 차단 용액을 제거합니다.
4. 100μL의 1차 항체 또는 차단 용액에 희석된 항체를 RT에서 1시간 동안 또는 4°C에서 O/N으로 각 슬라이드에 배양합니다. PBS로 슬라이드를 RT에서 각각 10분 동안 3회 헹굽니다.
5. RT에서 1시간 동안 차단 용액에 희석된 100μL의 2차 항체로 각 슬라이드를 배양합니다. RT에서 각각 10분 동안 PBS에서 슬라이드를 3회 헹굽니다. 빛으로부터 슬라이드를 보호합니다.
6. 슬라이드를 장착합니다.
   1. 슬라이드에 DAPI(4', 6-디아미디노-2-페닐린돌)가 함유된 페이드 방지 매체 두 방울을 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮으십시오.
   2. 이미지를 촬영할 준비가 될 때까지 4°C의 어두운 곳에서 보관하십시오.
      메모: 대안으로, 먼저 RT에서 PBS로 1:2,000으로 희석된 DAPI 또는 Hoechst 33324 염료로 핵에 라벨을 붙인 다음 글리세롤로 장착합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit 2차 항체	인비트로젠	A-11034
DAPI를 사용한 안티페이드 마운트런트	인비트로젠	P36931
소 혈청 알부민	시그마	A2153
커버슬립	피셔 브랜드	12-545-E
저온 유지 장치	라이카	CM1850
에디타	시그마	E6758
형광 현미경	올림푸스	BX51
현미경 슬라이드	피셔 브랜드	제12-550-15
OCT 컴파운드	피셔 헬스케어	제23-730-571
파라포름알데히드(PFA)	시그마	P6148
인산염 완충 식염수(PBS)	시그마	P4417
폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르	시그마	T9284	트리톤 X-100
토끼 anti-Ki67 항체	세포 신호 전달 기술	9129	롯#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 항체	세포 신호 전달 기술	13820	롯#:3; RRID:AB_2493181
구연산나트륨	시그마	1613859
트리스	시그마	10708976001

호 호 (영문) 년