Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

초록

출처: Tsuruta, F., et al. 형광 프로브를 사용하여 배양된 뉴런의 엔도솜 및 리소솜 운동성 정량화. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

프로토콜

1. 소포 운동성 이미징

1. 각 유형의 소포를 표지할 플라스미드를 준비합니다. 예를 들어, 초기 엔도솜에는 EGFP-Rab5, 후기 엔도솜에는 EGFP-Rab7, 리소좀에는 LAMP-EGFP를, 자가포식소체에는 EGFP-LC3를 사용합니다.
   메모: 이 플라스미드는 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp 의 요청에 따라 제공됩니다. 일반적으로 3-5일 in vitro(Division 또는 DIV) 뉴런은 transfection 시약을 사용하여 이러한 플라스미드로 transfection할 수 있습니다.
2. 피펫팅을 통해 4.0 μg의 플라스미드를 200 μL의 무혈청 배지와 혼합합니다. 별도의 튜브에서 8μL의 transfection 시약(재료 표 참조)을 200μL의 무혈청 배지에 희석합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
3. 1.2단계에서 plasmid solution과 transfection regent solution을 피펫팅으로 혼합합니다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
4. 1.3단계의 무혈청 배지와 400μL의 플라스미드 용액을 피질 뉴런, 대뇌 피질 배양 배지를 포함하는 각 코팅된 유....

결과

그림 1: 뉴런 수상돌기의 리소좀 운동성(Lysosome Motility). (A) 마우스 피질 뉴런(4 DIV)을 2일 동안 LAMP-EGFP 플라스미드로 형질주입했습니다. 이 이미지는 수상돌기에서 LAMP-EGFP 함유 소포의 운동성을 보여줍니다. 삽입은 LAMP-EGFP 양성 소포의 타임랩스 이미지를 보여줍니다. 빨간색 화살촉은 움직이는 소포를 나타내고 파란색 화살촉은 휴지 소포를 나타냅니다. 주황색 화살표는 위에서 언급한 것처럼 더 큰 형광 신호를 나타냅니다. 스케일 바 = 20μm. (B) 그림 A에서 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 종속 x축 위치. (b)로 표시된 빨간색 원 안의 소포는 움직이고 있고, (a)로 표시된 파란색 원 안의 소포는 쉬고 있습니다. 눈금자: 5 μm (왼쪽). 막대 그래프는 LA.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal 배지	써모 피셔	제21103-049
옵티-MEM	써모 피셔	31985070	세럼 프리 배지
페니실린 스트렙트마이신	써모 피셔	15140122
L-글루타민	써모 피셔	25030081
B-27 보충제	써모 피셔	17504044
poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마	P7280
폴리-L-오르니틴	시그마	P4957
리포펙타민 2000	써모 피셔	11668027	트랜스펙션(Transfection) 시약
폴리에틸렌이민 "최대"	폴리사이언스	24765	형질주입 시약. Lipofectamine2000의 대안으로 멸균수에 용해된 0.1mg/ml 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있습니다. 그러나 효율성이 낮고 독성이 높습니다.
비오레보 BZ-9000	키엔스	해당 없음
배양 시스템 INUG2-K13	토케이 히트	해당 없음
GraphPad Prism 버전 6.0	GraphPad 소프트웨어	해당 없음
엑셀 버전 15	마이크로소프트	해당 없음
ImageJ 버전 1.47	해당 없음	해당 없음

호 (영문) 년