Visualization of Vesicle Motilities in Neurons Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 뉴런의 소포 운동성 시각화)

Abstract

출처: Tsuruta, F., et al. 형광 프로브를 사용하여 배양된 뉴런의 엔도솜 및 리소솜 운동성 정량화. J. Vis. 특급 (2017).

이 동영상은 신경 소포의 움직임을 시각화하기 위해 특정 형광 단백질로 표지하는 방법을 보여줍니다. 먼저, 형광 단백질에 대한 플라스미드 코딩을 형질주입(transfection)제와 함께 배양한 다음 뉴런 배양액에 도입합니다. 그 후, 뉴런의 이미지를 획득하고 분석하여 소포의 움직임을 추적합니다.

Protocol

1. 소포 운동성 이미징

1. 각 유형의 소포를 표지할 플라스미드를 준비합니다. 예를 들어, 초기 엔도솜에는 EGFP-Rab5, 후기 엔도솜에는 EGFP-Rab7, 리소좀에는 LAMP-EGFP를, 자가포식소체에는 EGFP-LC3를 사용합니다.
   메모: 이 플라스미드는 tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp 의 요청에 따라 제공됩니다. 일반적으로 3-5일 in vitro(Division 또는 DIV) 뉴런은 transfection 시약을 사용하여 이러한 플라스미드로 transfection할 수 있습니다.
2. 피펫팅을 통해 4.0 μg의 플라스미드를 200 μL의 무혈청 배지와 혼합합니다. 별도의 튜브에서 8μL의 transfection 시약(재료 표 참조)을 200μL의 무혈청 배지에 희석합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
3. 1.2단계에서 plasmid solution과 transfection regent solution을 피펫팅으로 혼합합니다. RT에서 20분 동안 배양합니다.
4. 1.3단계의 무혈청 배지와 400μL의 플라스미드 용액을 피질 뉴런, 대뇌 피질 배양 배지를 포함하는 각 코팅된 유리 바닥 접시에 추가합니다. 37°C의 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 뉴런을 배양합니다. 배지를 2mL의 대뇌 피질 배양 배지로 교체합니다. 37 ° C의 5 % CO₂ 인큐베이터에서 1-2 일 동안 뉴런을 배양합니다 .
   메모: 1x B-27 보충제, 2mM L-글루타민 및 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 뉴런 기저 배지로 구성된 대뇌 피질 배양 배지를 준비합니다.
5. transfection 1 - 2일 후, 이미지 획득을 위해 transfection된 세포를 선택합니다.
   메모: 7 DIV 미만의 조기 뉴런은 동적 소포 운동성을 나타내는 경향이 있습니다. 형광 프로브를 적당히 발현하는 뉴런을 선택하면 발현이 높은 뉴런을 선택하면 선명한 이미지를 얻을 수 없기 때문에 선택합니다. 또한 축삭돌기와 수상돌기를 쉽게 식별할 수 있도록 긴 축삭돌기와 복잡한 수상돌기가 있는 피라미드 뉴런과 같은 일반적인 뉴런 모양을 선택합니다(그림 1A 참조).
6. 타임랩스 이미징 시스템을 사용한 이미지 획득: 이미징을 위해 40X Plan Apo 0.95NA 또는 100X Plan Apo VC NA1.4 대물 렌즈가 장착된 CCD(Charge-Coupled Device) 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용합니다. 배양 시스템을 사용하여 37°C에서 온도를 제어합니다. 이미지 획득 소프트웨어에 의해 제어되는 100초 동안 1프레임/5초의 뉴런 이미지를 획득합니다. 또는 더 짧은 간격과 더 긴 시간 동안(예: 300초 기간 동안 2초당 한 프레임) 이미지를 획득합니다.
   메모: 순차적 이미지를 촬영하기 위해 다양한 응용 프로그램을 사용할 수 있으며, 그 중 다수는 이 방법에 적합합니다. 따라서 특정 응용 프로그램은 권장되지 않습니다. 대신 각 연구자는 사용 가능한 모든 응용 프로그램을 사용해야 합니다.

2. 이미지 분석

1. 수동 추적을 사용하여 ImageJ 소프트웨어에서 모든 순차 이미지를 엽니다.
   메모: 지금까지 수동 추적은 추적 실험에 널리 사용되었습니다. 수동 추적은 Fabrice Cordelières 박사에 의해 개발되었습니다. 자세한 서면 지침은 온라인에서 확인할 수 있습니다. 분석을 위해 충분한 수의 이미지로 이미징 데이터의 품질이 향상됩니다. 20개 이상의 이미지를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 순차적인 이미지를 결합하려면 → → 을 선택합니다. 클릭.
3. → 선택하면 추적 창이 나타납니다.
4. 의 확인란을 클릭하고 매개 변수 섹션에서 추적 매개 변수를 정의합니다.
   메모: 시간 간격, x/y 보정, z 보정, 센터링을 위한 검색 사각형 크기, 도트 크기, 선 너비 및 글꼴 크기를 포함한 여러 매개변수를 설정할 수 있습니다. 이 단순화된 분석에서는 시간 간격과 x/y 보정이 모두 정의되었습니다. 다른 실험 상황에서는 다른 파라미터도 정의해야 할 수 있습니다. 여기에 사용된 매개변수는 5초이며 40X Plan Apo 0.95NA 대물 렌즈의 경우 0.26642μm 또는 100X Plan Apo VC NA1.4 대물 렌즈의 경우 0.10657μm입니다.
5. 매개변수를 정의한 후 on을 클릭하여 새 트랙을 시작합니다.
6. 관심 있는 소포(예: 그림 1A(오른쪽 패널)에서 파란색 및 빨간색 화살표로 표시된 소포)를 결정한 후 순차적 이미지에서 신호의 중심을 클릭하여 xy 좌표를 기록합니다. 기록된 xy 좌표, 거리 및 속도의 결과가 새 창에 표시됩니다.
   메모: 리소좀의 경우, 크고 밝은 형광 신호(예: 그림 1A(오른쪽 패널), 주황색 화살촉)이 뉴런에서 자주 관찰됩니다. 이러한 신호는 때때로 축적된 소포 또는 병리학적 정맥류를 나타내므로 운동성을 정량화하기 위해 이러한 신호는 피해야 합니다.
7. 2.6단계를 반복하여 모든 순차적 이미지에서 소포의 xy 좌표를 수집합니다. 참조점을 선택한 후 각 이미지는 자동으로 연속 이미지로 이동합니다.
8. 이러한 데이터를 새 테이블(예: 스프레드시트)로 내보냅니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 적절한 그래프를 만듭니다(재료 표 참조).
   메모: 데이터를 분석하려면 열을 선택하고, 이 열의 모든 값을 합산하고, 그림 1B와 같이 운동 거리를 막대 그래프로 표시합니다. 또한 이 단계를 반복하고 총 운동성 거리의 평균을 계산하고 그림 1C와 같이 막대 그래프로 표시합니다. 막대 그래프와 파형 데이터를 생성하는 소프트웨어는 재료 표에 나와 있습니다.

Results

그림 1: 뉴런 수상돌기의 리소좀 운동성(Lysosome Motility). (A) 마우스 피질 뉴런(4 DIV)을 2일 동안 LAMP-EGFP 플라스미드로 형질주입했습니다. 이 이미지는 수상돌기에서 LAMP-EGFP 함유 소포의 운동성을 보여줍니다. 삽입은 LAMP-EGFP 양성 소포의 타임랩스 이미지를 보여줍니다. 빨간색 화살촉은 움직이는 소포를 나타내고 파란색 화살촉은 휴지 소포를 나타냅니다. 주황색 화살표는 위에서 언급한 것처럼 더 큰 형광 신호를 나타냅니다. 스케일 바 = 20μm. (B) 그림 A에서 LAMP-EGFP 양성 소포의 시간 종속 x축 위치. (b)로 표시된 빨간색 원 안의 소포는 움직이고 있고, (a)로 표시된 파란색 원 안의 소포는 쉬고 있습니다. 눈금자: 5 μm (왼쪽). 막대 그래프는 LA...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal 배지	써모 피셔	제21103-049
옵티-MEM	써모 피셔	31985070	세럼 프리 배지
페니실린 스트렙트마이신	써모 피셔	15140122
L-글루타민	써모 피셔	25030081
B-27 보충제	써모 피셔	17504044
poly-D-lysine 하이드로 브로마이드	시그마	P7280
폴리-L-오르니틴	시그마	P4957
리포펙타민 2000	써모 피셔	11668027	트랜스펙션(Transfection) 시약
폴리에틸렌이민 "최대"	폴리사이언스	24765	형질주입 시약. Lipofectamine2000의 대안으로 멸균수에 용해된 0.1mg/ml 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있습니다. 그러나 효율성이 낮고 독성이 높습니다.
비오레보 BZ-9000	키엔스	해당 없음
배양 시스템 INUG2-K13	토케이 히트	해당 없음
GraphPad Prism 버전 6.0	GraphPad 소프트웨어	해당 없음
엑셀 버전 15	마이크로소프트	해당 없음
ImageJ 버전 1.47	해당 없음	해당 없음