면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

Abstract

출처: Wallrafen, R., et al. 면역형광을 사용하여 마우스 뇌에서 시냅스 단백질의 이질적 분포를 정량화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 면역형광

1. 차단 완충액, 항체 완충액, 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2를 포함하는 용액을 준비합니다(표 1 참조).
2. 과도한 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 제거하기 위해 인산염 완충액(PB)으로 슬라이스를 한 번 헹굽니다.
   1. 뇌 조각을 빨아들이지 않고 플라스틱 피펫으로 용액을 제거하십시오. 1000 μL 피펫으로 250 μL의 새로운 PB를 추가합니다.
      주의: 조각이 마르지 않아야 하므로 액체를 잘 제거하고 추가하십시오.
3. 플라스틱 피펫으로 PB를 제거하고 1000μL 피펫으로 웰당 250μL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 셰이커에서 실온(RT)에서 3시간 동안 배양합니다.
4. 배양 시간 동안 반응 튜브의 항체 완충액에 있는 1차 항체를 희석합니다. 웰당 250μL 항체 완충액을 사용하고 2μL 피펫을 사용하여 용액에 직접 피펫팅하여 적절한 양의 항체(표 2 참조)를 추가합니다. 여러 번 위아래로 ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 반응 튜브	에펜도르프	30120094
50 mL 반응 튜브	Greiner 바이오 원	227261
멀티웰 24웰	피셔 사이언티픽	087721H
플라스틱 피펫(일회용)	사르슈테트	8,61,176
1000 mL 피펫	라이닌	17014382
2ml 피펫	에펜도르프	3123000012
소용돌이 천재 3	이카	3340001
Menzel 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	10144633CF
입체경	라이카
LSM800	자이스		컨포칼 현미경
PBS(10배)	로슈	11666789001
티슈 텍	사쿠라	4583	10월
나2HPO4	바이오프록스	5155KG001
나H2PO4	머 크	1,06,34,60,500
노멀 염소 세럼	머크 밀리포어	S26-100ML
노멀 당나귀 세럼	머 크	S30-100ML
트리톤 X-100	머 크	1,08,60,31,000
토끼 안티 무버	시냅스 시스템	RRID: AB_10804285
기니피그 항 Synaptophysin	시냅스 시스템	RRID: AB_1210382
당나귀 안티 토끼 AF647	잭슨 이뮤노리서치	RRID: AB_2492288
염소 안티 마우스 AF488	잭슨 이뮤노리서치	RRID: AB_2337438
모위올4-88	칼바이오켐	475904
ZEN2 블루 소프트웨어	자이스		현미경 검사 소프트웨어
피지	이미지J		해석 소프트웨어
마이크로소프트 엑셀	마이크로소프트