면역형광을 이용한 쥐 뇌의 시냅스전 단백질 분포 정량화(Quantifying the Distribution of a Presynaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence)

초록

출처: Wallrafen, R., et al. 면역형광을 사용하여 마우스 뇌에서 시냅스 단백질의 이질적 분포를 정량화. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 특정 시냅스전 단백질의 분포를 정량화하기 위해 마우스 뇌 절편의 면역형광 염색을 보여줍니다. 이 프로세스에는 비특이적 부위를 차단하고, 표적 단백질에 대한 1차 항체와 참조 마커를 적용한 다음, 2차 항체 라벨링 및 핵 counterstaining이 포함됩니다. 참조 마커는 일관된 기준선을 제공하여 정확한 정량화를 보장하며, 공초점 현미경을 사용하여 뇌 영역 전반에 걸쳐 시냅스전 단백질의 분포를 분석합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 면역형광

1. 차단 완충액, 항체 완충액, 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2를 포함하는 용액을 준비합니다(표 1 참조).
2. 과도한 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 제거하기 위해 인산염 완충액(PB)으로 슬라이스를 한 번 헹굽니다.
   1. 뇌 조각을 빨아들이지 않고 플라스틱 피펫으로 용액을 제거하십시오. 1000 μL 피펫으로 250 μL의 새로운 PB를 추가합니다.
      주의: 조각이 마르지 않아야 하므로 액체를 잘 제거하고 추가하십시오.
3. 플라스틱 피펫으로 PB를 제거하고 1000μL 피펫으로 웰당 250μL의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 셰이커에서 실온(RT)에서 3시간 동안 배양합니다.
4. 배양 시간 동안 반응 튜브의 항체 완충액에 있는 1차 항체를 희석합니다. 웰당 250μL 항체 완충액을 사용하고 2μL 피펫을 사용하여 용액에 직접 피펫팅하여 적절한 양의 항체(표 2 참조)를 추가합니다. 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 잠시 후 Vortex.
   메모: 배경 형광을 측정하려면 1차 항체를 추가하지 않고 염색도 수행해야 합니다. 이를 위해 프로토콜에 따라 1차 항체가 없는 항체 용액에서 slice를 배양합니다.
5. 배양 시간 후, 플라스틱 피펫으로 차단 버퍼를 제거하고 웰당 1차 항체를 포함하는 250μL의 항체 용액을 추가합니다. 쉐이커에서 4 °C에서 밤새 기본 항체가 포함된 슬라이스를 배양합니다.
6. 다음날, 셰이커에서 RT로 10분 동안 세탁 버퍼를 1 3회 세척합니다.
   1. 플라스틱 피펫으로 매체를 제거하고 웰당 300μL의 세척 버퍼(1)를 추가합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다. 3회 반복합니다.
7. 세척 단계에서 반응 튜브의 항체 완충액에 형광단 결합 2차 항체를 희석합니다. 웰당 250μL 항체 완충액을 사용하고 2μL 피펫을 사용하여 용액에 직접 피펫팅하여 적절한 양의 항체(표 2 참조)를 추가합니다. 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 적절한 혼합을 보장하기 위해 잠시 후 Vortex.
   주의: 항체는 빛에 민감하기 때문에 이 시점부터 모든 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
8. 세척 단계 후 플라스틱 피펫으로 세척 버퍼를 제거하고 웰당 2차 항체가 포함된 항체 용액 250μL를 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 90분 동안 2차 항체로 슬라이스를 배양합니다.
9. RT에서 10분 동안 세탁 버퍼(2 3)로 슬라이스를 씻습니다.
10. 세척 단계에서 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 0.1M PB에 1:2000 농도로 희석합니다.
11. 플라스틱 피펫으로 세척 버퍼2를 제거하고 웰당 250μL의 DAPI 용액을 추가합니다. 셰이커에서 RT로 5분 동안 배양합니다.
12. 플라스틱 피펫으로 DAPI 용액을 제거하고 1000μL 피펫으로 웰당 0.1M PB 500μL를 추가합니다.
13. 현미경 슬라이드에 슬라이스를 장착합니다.
    1. 스테레오스코프 아래에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 가는 브러시로 0.1M PB를 슬라이드에 세 방울 떨어뜨립니다. 한 방울당 한 조각을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
    2. 가는 브러시를 사용하여 현미경 슬라이드의 슬라이스를 평평하게 하고 방향을 지정합니다.
    3. 모든 슬라이스가 올바르게 배치되면 티슈로 여분의 PB를 제거하고 슬라이드를 조심스럽게 말리십시오.
       주의: 뇌 조각을 완전히 건조시키지 마십시오.
    4. 슬라이드에 80μL의 임베딩 배지를 추가합니다. 커버슬립을 슬라이드 위로 조심스럽게 내려 뇌 조각을 삽입하십시오.
    5. 슬라이드를 흄 후드에서 1-2시간 동안 건조시킨 후(빛 노출을 피하기 위해 덮음) 4°C의 현미경 슬라이드 상자에 보관합니다.
       메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 이미징

1. 매립 매체가 완전히 경화된 후 현미경 슬라이드를 컨포칼 현미경 아래에 놓습니다.
   메모: 디콘볼루션 소프트웨어와 결합된 에피형광 현미경 검사는 유사한 이미지 품질을 제공해야 합니다.
2. 모든 채널에 대한 레이저 강도를 높이거나 낮춰 레이저 설정을 조정하여 회색 값의 최대 분포를 보장하기 위해 몇 개의 픽셀이 과다 노출되도록 합니다.
3. 서로 다른 채널에 대한 전체 뇌 절편의 가상 조직을 획득합니다.
   1. 이미징 소프트웨어에서 Tiles(타일) 옵션을 선택하고 Tile Region Setup(타일 영역 설정)을 사용하여 브레인 슬라이스를 수동으로 묘사합니다.
   2. 타일 영역 전체에 지지점을 분산하고 Verify Tile Regions/Positions를 눌러 다른 지지점 중 하나에 대한 초점을 조정합니다....
   3. 결과 이미지의 원하는 해상도와 파일 크기에 따라 획득 모드에서 설정을 조정하고 스캔을 시작합니다.
4. 스캔이 완료되면 스티칭 기능을 사용하여 가상 조직을 처리합니다. Image Export 함수를 사용하여 파일을 .tif로 내보냅니다.

3. 컴퓨터 기반 분석

1. File(파일)| 열기.
2. Freehand 선택 도구를 사용하여 DAPI 채널에서 하나의 반구를 묘사합니다. Edit(편집)| 선택| 마스크를 만듭니다.
Analyze(분석)를
3. 클릭하여 단일 채널(Mover 및 synaptophysin)에 대한 평균 형광 강도를 결정합니다. 측정.
   메모: 각 채널의 평균 형광 강도 값을 결정하기 위해 다른 채널을 선택해야 합니다.
4. 단일 채널의 평균 형광 강도를 스프레드시트에 복사합니다.
5. 관심 영역에 있는 단일 채널에 대한 평균 형광 강도를 결정하려면 Freehand selection 도구로도 영역을 묘사합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조로 사용하십시오.
6. 모든 반구 및 모든 관심 영역에 대해 3.1-3.5단계를 반복합니다.
   메모: 나중에 관심 영역의 값을 반구의 값과 비교하기 위해 각 반구의 값을 개별적으로 결정합니다(4.2단계 참조).

4. 데이터 처리

1. 배경 형광이 높은 경우 배경 빼기가 필요할 수 있습니다. 이를 위해 기준 단백질(여기서는 synaptophysin)에 대해 1차 항체 없이 처리된 슬라이스의 평균 형광 강도를 결정하고 뇌 영역과 반구에 대해 얻은 모든 값에서 해당 값을 뺍니다.
2. 모든 반구 및 모든 관심 영역에 대한 단일 채널에 대한 평균 형광 강도가 결정되면(표 3 참조), Mover에 대한 값을 synaptophysin에 대한 값으로 나누어 Mover와 synaptophysin의 비율을 계산합니다(표 3의 노란색). 모든 반구와 모든 관심 영역에 대해 이 작업을 개별적으로 수행합니다.
3. 한 관심 영역에 대해 얻은 비율을 해당 반구에 대해 얻은 비율(표 3의 주황색)로 나누어 반구에 대한 관심 영역의 비율을 결정합니다.
4. 상대적인 Mover 존재도를 결정하려면 4.2에서 얻은 비율을 1로부터의 편차를 결정하여 백분율로 변환합니다(표 3의 빨간색). 따라서 비율 1.25는 평균보다 25% 높은 상대적 Mover 풍부도를 제공하고 0.75의 비율은 평균보다 25% 낮은 상대적 Mover 풍부도를 제공합니다.

표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션.

정착제(500mL)
20g 파라포름알데히드 혼합(총 농도: 4%) 50 mL 10x PBS 스톡 용액(총 농도: 1x) 450 mL bidest H2O는 NaOH 로 pH를 7.4로 조절합니다. 참고: PBS의 파라포름알데히드를 해결하려면 용액을 가열하십시오. PFA는 70 oC. 이상의 온도에서 분해되므로 70 oC 이상으로 가열하지 마십시오. 주의: PFA는 독성이 있으며 잠재적으로 발암성 및 기형성을 유발합니다. PFA로 작업할 때는 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 섭취를 피하십시오.
0.1M PB(1L)
재고 솔루션 X 35.61 g Na2HPO4.2H 2O 1 L bidest H2O	재고 솔루션 Y 27.60g NaH2PO4.2H 2O in 1 L bidest H2O
385mL 스톡 용액 X 혼합 115mL 원액 Y 500 mL 바이스트 H2O
차단 버퍼(50mL)
1.25mL 일반 염소 세럼 혼합(총 농도: 2.5%) 1.25mL 노멀 당나귀 세럼(총 농도: 2.5%) 0.5mL 비이온 계면활성제(Triton-X100, 총 농도: 1%) 47mL 0.1M PB
항체 완충액 (50 mL)
0.25mL 일반 염소 세럼 혼합(총 농도: 0.5%) 0.25mL 노멀 당나귀 세럼(총 농도: 0.5%) 0.1mL 비이온 계면활성제(총 농도: 0.2%) 49.4mL 0.1M PB
세척 버퍼 1 (50mL)
1mL 일반 염소 세럼 혼합(총 농도: 2 %) 49mL 0.1M PB
세척 버퍼 2 (50mL)
0.5mL 일반 염소 혈청 혼합(총 농도: 1 %) 49.5mL 0.1M PB

표 2: 이 프로토콜에 사용된 항체.

발표 발표 발표 발표

일차 항체와 관련상품
대상에 대한 지시	숙주 종	RRID는	농도
발동기	토끼	AB_10804285	1:1000
시냅토피신	기니피그	AB_1210382	1:1000
2차 항체와 관련상품
대상 종	숙주 종	형광단	농도
토끼	당나귀	알렉사플루어 647	1:1000
기니피그	염소	알렉사플루어 488	1:1000

표 3: 데이터 처리의 예.

년 분 년 년

반구
반구 #	평균 형광 강도 Synaptophysin (AU)	평균 형광 강도 Mover (A.U.)	비율 Mover/Synaptophysin
1 2 3 4 5 6	29.134 31.008 38.641 30.775 21.658 27.277	22.810 24.046 29.324 25.444 18.091 23.364	=C3/B3 0.783 =C4/B4 0.775 =C5/B5 0.759 =C6/B6 0.827 =C7/B7 0.835 =C8/B8 0.857
해마
반구 #	평균 형광 강도 Synaptophysin (AU)	평균 형광 강도 Mover (A.U.)	비율 Mover/Synaptophysin	반구에 대한 비율	상대적 무버 풍부도(%)
1 2 3 4 5 6	35.26 33.955 41.231 39.853 30.129 28.737	29.889 27.825 31.978 31.787 27.817 25.861	=C11/B11 0.848 =C12/B12 0.819 =C13/B13 0.776 =C14/B14 0.798 =C15/B15 0.923 =C16/B16 0.900	=D11/D3 1.083 =D12/D4 1.057 =D13/D5 1.022 =D14/D6 0.965 =D15/D7 1.105 =D16/D8 1.051	=(E11-1)*100 8.269 =(E12-1)*100 5.673 =(E13-1)*100 2.200 =(E14-1)*100 -3.528 =(E15-1)*100 10.530 =(E16-1)*100 5.064

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 반응 튜브	에펜도르프	30120094
50 mL 반응 튜브	Greiner 바이오 원	227261
멀티웰 24웰	피셔 사이언티픽	087721H
플라스틱 피펫(일회용)	사르슈테트	8,61,176
1000 mL 피펫	라이닌	17014382
2ml 피펫	에펜도르프	3123000012
소용돌이 천재 3	이카	3340001
Menzel 현미경 슬라이드	피셔 사이언티픽	10144633CF
입체경	라이카
LSM800	자이스		컨포칼 현미경
PBS(10배)	로슈	11666789001
티슈 텍	사쿠라	4583	10월
나2HPO4	바이오프록스	5155KG001
나H2PO4	머 크	1,06,34,60,500
노멀 염소 세럼	머크 밀리포어	S26-100ML
노멀 당나귀 세럼	머 크	S30-100ML
트리톤 X-100	머 크	1,08,60,31,000
토끼 안티 무버	시냅스 시스템	RRID: AB_10804285
기니피그 항 Synaptophysin	시냅스 시스템	RRID: AB_1210382
당나귀 안티 토끼 AF647	잭슨 이뮤노리서치	RRID: AB_2492288
염소 안티 마우스 AF488	잭슨 이뮤노리서치	RRID: AB_2337438
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