Drosophila에서 등쪽 종근 신경근 접합부의 구조적 무결성 평가

초록

출처: Sidisky, J. M., et al. 신경 퇴행과 관련하여 성인 초파리의 시냅스 퇴행 시각화. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 초파리의 등쪽 종방향 근육에서 신경근 접합부의 구조적 무결성을 평가하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 절차에는 뉴런과 근육을 두 개의 서로 다른 항체로 염색하고 돌연변이 파리와 야생형 파리 사이의 형광 패턴을 비교하는 것이 포함됩니다. 돌연변이 파리에서 신경 염색의 감소는 근육 구조가 손상되지 않은 상태에서 신경 퇴행을 나타냅니다.

프로토콜

1. 급속 동결 및 흉부 이분

1. 이분절을 시작하기 전에 적절한 극저온 보호 장갑과 보안경을 착용하고 Dewar 플라스크에 액체 질소를 채웁니다. 칼날 차단기, 깃털 칼날, 가는 집게 한 쌍, 얼음, 얼음처럼 차가운 1x PBS, 극저온 핀셋을 얻습니다.
2. 1x PBS 얼음을 차갑게 유지하기 위해 얼음 양동이를 준비합니다.
3. 칼날 브레이커를 사용해 깃털 칼날을 비스듬히 잡고 칼날을 구부려 작은 조각을 떼어내세요. 그런 다음 블레이드 브레이커는 작은 메스로 사용하기 위해 블레이드를 제자리에 잠글 수 있습니다.
   메모: 하나의 블레이드는 모든 그룹에 대해 지속되어야 합니다. 칼날이 부러지거나 무뎌지면 전환하십시오.
4. 깨끗한 피펫 팁을 P200에 추가하고 팁의 1/5을 제거하여 샘플을 운반합니다.
5. 각 그룹에 대해 새로운 마이크로 원심분리 튜브를 준비하고 각 튜브에 200μL의 1x PBS를 추가합니다. 이 두 번째 튜브는 최종 DLM 프렙을 수집하는 데 사용됩니다.
6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 튜브에서 1x PBS를 모두 제거합니다.
7. 적절한 보호 장비를 착용하고 극저온 핀셋을 사용하여 튜브를 액체 질소 플라스크에 10초 동안 담그십시오.
   메모: 튜브가 폭발하지 않도록 튜브를 단단히 닫아야 합니다.
8. 액체 질소에서 튜브를 제거하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘플에 약 300μL의 얼음처럼 차가운 1x PBS를 추가합니다. 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.
9. 실리콘 엘라스토머로 코팅된 10cm 해부 접시에 얼음처럼 차가운 1x PBS를 추가하고 변형된 200μL 피펫으로 첫 번째 흉부를 분주합니다.
10. 흉부 복부 쪽을 위로 향하게 놓습니다. 한 손에는 둔한 집게를 사용하여 흉부의 위치를 정하고 다른 손에는 가는 집게를 사용하여 흉부의 정중선을 노출시키기 위해 흉부신경절의 일부를 제거합니다.
11. 흉부의 정중선을 가이드로 사용하여 칼날로 흉부의 1/3을 얕게 자릅니다.
12. 흉부에서 칼날을 제거하고 뭉툭한 집게로 흉부를 45° 각도로 배치합니다. 칼날을 다시 삽입하고 흉부의 정중선을 똑바로 자릅니다. 이것은 두 개의 반구형 결과를 낳을 것입니다.
13. 한 번에 하나의 반흉을 취하고 가장 복부 섬유인 DLM 근섬유 F(그림 1B) 아래의 과도한 조직을 제거합니다. 칼날을 사용하여 DLM을 손상시키지 않고 과도한 조직을 제거하기 위해 하나 또는 두 개의 조심스럽게 절단합니다.
14. 일단 분리되면 1x PBS를 사용하여 반흉을 올바른 튜브로 옮깁니다.
15. 그룹당 10개의 절개된 반구가 만들어질 때까지 1.6-14단계를 반복합니다.

2. 구조적 염색

1. 흉부 샘플을 이등분한 후 조직을 차단 완충액(0.1% 정상 염소 혈청이 있는 1x PBS 및 pH 7.4에서 0.2% Triton X-100)에 넣어 조직을 투과화하고 비특이적 염색을 방지합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 과도한 1x PBS를 제거하고 각 튜브에 1.5mL의 차단 버퍼를 추가합니다. 4°C에서 최소 1시간 동안 조직을 차단합니다.
2. 형광 접합 항체인 양고추냉이 과산화효소 488(anti-HRP-488)을 1:200으로 희석하고 차단 완충액에서 1:1000으로 Phalloidin-647을 사용하여 운동 뉴런과 근육 조직을 각각 염색하기 위해 구조적 염색을 위한 샘플을 준비합니다. 튜브당 150μL가 되도록 충분한 염색을 만듭니다. 염색할 준비가 될 때까지 호일로 덮인 4°C 또는 어두운 상자에 얼룩
을 보관하십시오.
3. 차단 후 유리 파스퇴르 피펫으로 과도한 차단 버퍼를 제거하십시오.
4. 구조적 얼룩을 분배하기 전에 얼룩을 와류로 만듭니다. 각 튜브에 150μL의 염색을 추가합니다. 샘플을 실온에서 2시간 동안 회전기의 어두운 상자에 넣습니다.
5. 얼룩을 제거하고 어두운 상자의 로테이터에서 0.3% Triton X-100이 포함된 1.5mL의 실온 1x PBS에서 티슈를 5분 동안 4회 세척합니다. 이제 샘플을 슬라이드에 장착할 준비가 되었습니다.

3. 조직 장착

1. PBST에서 샘플을 세척한 후 염색을 위해 조직을 장착할 현미경 슬라이드를 준비합니다. 유리 커버 슬립, P200 파이펫, 200μL 파이펫 팁, 가위, 투명 보강재, 직선 모서리 집게, 페이드 방지 형광 장착 매체, 매니큐어 및 슬라이드를 덮을 어두운 상자를 포함한 추가 소모품을 준비합니다.
2. 샘플을 식별하기 위해 슬라이드에 레이블을 붙이고 Kim 물티슈로 청소하여 얼룩을 제거합니다.
3. 커버 슬립이 반흉부 샘플을 손상시키지 않도록 하려면 보강 라벨을 사용하여 "브리지"를 구축하십시오. 하나의 보강 라벨을 반으로 자르고 각 절반을 약 15mm 간격으로 배치합니다. 이 거리는 커버 슬립의 너비보다 작아야 합니다. 이 단계를 네 번 반복하여 5개 레이블 높이의 "브리지"를 완성합니다.
4. P200 파이펫을 사용하여 팁의 1/5을 잘라 샘플을 슬라이드로 옮깁니다. 샘플은 다리 중앙의 슬라이드로 옮겨야 합니다.
5. 실험실용 물티슈의 가장자리를 잡고 여분의 PBST를 제거합니다. 겸자를 사용하여 모든 샘플이 근육 면이 위를 향하고 큐티클 면이 아래를 향하도록 DLM을 배열합니다.
6. 표준 P200 피펫 팁을 사용하여 기포를 방지하면서 슬라이드에 70μL의 장착 매체를 적용합니다. 외부에서 시작하여 중앙으로 보강재 내부에 원형 패턴으로 매체를 분배합니다.
7. 보강재 위에 커버 슬립을 놓습니다.
8. 매니큐어를 사용하여 커버슬립 둘레의 바깥쪽 가장자리를 코팅합니다. 조직을 완전히 밀봉하기 위해 넉넉하게 바르십시오.
9. 슬라이드를 어두운 평평한 표면에 놓고 최소 10분 동안 건조시키고 광표백이나 형광 손실을 방지합니다. 이제 슬라이드를 이미징에 즉시 사용하거나 나중에 볼 수 있도록 -20°C의 슬라이드 폴더에 저장할 수 있습니다.

결과

그림 1 : ALS의 초파리 모델에서 DLM 시냅스의 점진적 탈신경화. (A) 43kDa(TDP-43)의 Tar-Binding Protein의 인간 돌연변이 형태를 발현하는 ALS 형질전환 파리의 발생이 회로도에 나와 있습니다. (B) 그림은 성인 초파리에서 반흉부의 모양과 방향을 묘사합니다. 이 프로토콜을 사용하여 운동 뉴런을 HRP(녹색)로, 근육 조직을 Phalloidin(자홍색)으로 구조적으로 염색하여 DLM NMJ 시냅스의 시냅스 무결성이 점진적으로 손실되는 것을 관찰할 수 있습니다. 본 연구의 모델은 운동 뉴런(그림 1F-H)에서 인간 TDP-43M337V의 돌연변이를 발현하는 성체 파리...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
포름알데히드 32%	전자 현미경 과학	15714	조직 보존
벤치로커	제네시 사이언티픽	31-302	염색 중 시료 회전
블레이드 브레이커	정밀 과학 도구	10053-09	깃털 잎을 붙들기를 위해 사용하는
커버 슬립	피셔 사이언티픽	12548ᅡ	티슈 장착용
극저온 장갑	폭스바겐	97008-198	액체 질소로부터 손을 보호하십시오
극저온 핀셋	폭스바겐	82027-432	2.0mL 튜브를 액체 질소에 담습니다
듀어 플라스크 - 1900 mL	토마스 사이언티픽	5028분 54	액체 질소 보유
깃털 블레이드	전자 현미경 과학	72002-01	메스 블레이드
파인 포레프스 x 2	정밀 과학 도구	11252-20	흉부의 정중선 청소를 위한 한 쌍의 미세한 쌍. 다른 한 쌍은 숫돌을 사용하여 무뎌질 수 있습니다.
FITC-conjugated anti HRP	잭슨 연구소	Tel.: 123-545-021	염색 운동 뉴런. 1:100 농도에서 사용
냉동실 상자 (블랙)	피셔 사이언티픽	14100층	빛으로부터 시료 보호
유리 파스퇴르 피펫	폭스바겐	제14637-010	시료 전송에 사용
유리 슬라이드	피셔 사이언티픽	12550143	티슈 장착용
마운팅 미디어(vectashield) 페이드 방지	폭스바겐	제101098-042	장착 매체는 형광 신호를 유지합니다
매니큐어	전자 현미경 과학	72180	씰링 현미경 슬라이드
노멀 염소 세럼	피셔 사이언티픽	PCN5000	항체의 비특이적 결합 방지
페인트 브러시	제네시 사이언티픽	59-204	파리 옮기기
PBS (PBS)	피셔 사이언티픽	10-010-023	해부 및 염색을 위한 식염수
팔로이딘 647	아브캠	AB176759	근육 조직에서 F-Actin을 염색합니다. 1:1000 농도에서 사용
플라스틱 페트리 접시 (100mm)	폭스바겐	제25373-100	해부 접시
강화 라벨	W.B. 메이슨	AVE05722	장착된 티슈 위의 유리 커버슬립을 지지합니다.
샤프닝 블록	그레인저	1RDF5	미세한 집게를 날카롭게 유지하고 별도의 쌍을 둔하게 만듭니다.
슬라이드 폴더	폭스바겐	10126-326	시료 보관
표준 사무용 가위	W.B. 메이슨	ACM40618	강화 라벨 절단
실가드 184	전자 현미경 과학	24236-10	해부 접시용 코팅
트리톤-X-100	전자 현미경 과학	22140	조직을 투과시키는 데 도움
Vannas Diss해부 시저	정밀 과학 도구	1500-00	파리 다리를 제거하고 흉부를 절개하기 위한 Ued