Investigating a a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy(대규모 주사 투과 전자 현미경을 사용한 제브라피시 유충 뇌 손상 조사)

초록

출처: Kuipers, J. et al., 건강하고 부상당한 제브라피시 뇌의 대규모 주사 투과 전자 현미경(나노토미).J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 주사 전자 현미경(SEM)과 투과 전자 현미경(TEM)의 요소를 결합하여 고해상도 이미지를 생성하는 기술인 대규모 주사 투과 전자 현미경(STEM)을 사용하여 제브라피시 유충의 뇌 손상을 조사하는 방법을 보여줍니다. 뇌 손상을 식별하기 위해 샘플을 준비하고 고해상도 STEM 이미지를 획득하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 고정 및 임베딩
   1. 고정
      1. E3(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl₂, 0.33mM MgSO_4, 10mM HEPES, pH 7.6) 제브라피시 물에 첨가된 트리카인(0.003%)의 어류 유충을 마취하고 움직임이 더 이상 감지되지 않을 때까지 해부 현미경으로 200μl 피펫 팁으로 부드럽게 찌르는 방식으로 마취 깊이를 테스트합니다(그림 1A).
      2. 설명된 대로 1.8% 아가로스에서 컨포칼 또는 2광자 이미징을 사용하여 생체 내 이미징 데이터를 획득한 후 상관 전자 현미경(EM)을 위한 샘플을 처리할 때 Triton-X-100(0.05%)을 함유한 인산염 완충 식염수(PBS)에서 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 아가로스에서 유충을 고정합니다.
      3. 아가로스에서 유충을 잘라 대규모 EM을 가공합니다.
      4. 플라스틱 튜브에 실온에서 2시간 동안 Triton-X-100(0.05%)을 함유한 PBS의 신선한 4% 파라포름알데히드로 유충을 고정합니다.
         메모: 배양(시험관내)에서 성장한 세포는 다음 단계(1.1.1.5)에 설명된 대로 글루타르알데히드에 직접 고정할 수 있습니다.
      5. 용액을 제거하고 100μl 0.5% PFA, 2% 글루타르알데히드(GA) 및 0.1M 카코딜산나트륨(pH 7.4)을 추가합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 0.1 M 카코딜 레이트 나트륨에서 샘플을 두 번 헹굽니다.
      6. 오스뮴의 침투를 용이하게 하기 위해 유충 머리를 후뇌로 자릅니다. 가는 주사기/집게를 사용하십시오.
      7. 1% 오스뮴 테트록사이드(OsO₄)/1.5% 페로시안화칼륨(K₄[Fe(CN)₆])의 후위 유충을 0.1M 카코딜레이트 나트륨에 넣고 얼음에서 2시간 동안 헹구고 이중 증류된 H₂O에서 3 x 5분 동안 헹굽니다.
      8. 에탄올 농도를 증가시키는 (50 %, 70 %, 3 배 100 %)에서 20 분 배양으로 에탄올을 탈수합니다.
   2. 포함
      1. EM 실험실에서 사용되는 표준 레시피에 따라 에폭시 수지를 준비합니다.
         메모: 에폭시 수지를 사용하는 방법은 다음과 같습니다 : 자석 교반기를 사용하여 19.8g의 글리시드 에테르 100, 9.6g의 2-도데 세닐 숙신산 무수물 및 11.4g의 메틸 나딕 무수물을 혼합합니다. DMP-30 0.5g(트리스-(디메틸아미노메틸)페놀)을 넣고 다시 섞는다.
      2. 유충을 에탄올(v/v)의 50% 에폭시 수지로 하룻밤 동안 배양하면서 회전(RT)합니다.
      3. 희석된 에폭시 수지를 순수 수지로 교체하십시오. 30분 동안 배양하고 새 레진을 다시 추가한 다음 30분 더 배양합니다. 다시 레진을 새로 고친 다음 RT에서 3시간 배양한 다음 58°C에서 15분, 저압(200mbar)에서 RT에서 1시간 더 배양합니다.
      4. 시중에서 판매되는 실리콘 평면 임베딩 몰드에서 바늘이나 이쑤시개를 사용하여 앞쪽이 금형 측면을 향하도록 또는 필요에 따라 해부 현미경 아래에서 헤드의 방향을 지정합니다(그림 1B).
      5. 에폭시 수지를 58 °C에서 하룻밤 동안 중합시킵니다. 에폭시 수지가 여전히 너무 부드러우면 하루 더 중합하고 58°C에서 경화시킵니다. 집게를 사용하여 압력을 가하여 강성을 테스트합니다. 이것이 쉽게 움푹 들어간 곳을 남기면 다른 날이 58 °C에서 중합되고 경화되도록 하십시오. 시편이 완전히 경화되면 트리밍 및 절단을 진행합니다.
      6. 면도날을 사용하여 스텁에서 여분의 수지를 잘라냅니다(그림 1B).
2. Sectioning, Contrasting, and Mounting (절단, 대비, 장착)
   1. 단면화
      1. 초박 절편기를 이용한 단면 에폭시 수지 블록.
      2. 유리 나이프 또는 다이아몬드 히스토나이프를 사용하여 톨루이딘 블루/염기성 푹신(그림 1D) 염색을 위한 반박형 절편(500nm)을 절단하여 올바른 위치를 감지합니다.
      3. 미세한 슬라이드의 반박형 부분을 화염에 녹여 끝이 닫힌 유리 파스퇴르 피펫으로 집어 올려 옮깁니다. 물이 남지 않을 때까지 열판에서 말리십시오. 핫 플레이트의 물에 1% 톨루이딘 블루로 10초 동안 염색하고 물로 헹군 후 1% 테트라붕산나트륨 중 0.05% 염기성 푸시온으로 10초 동안 염색합니다. 일반 광학 현미경으로 10X - 40X로 검사합니다.
      4. 뇌 내의 적절한 부위/방향에 도달하면 다이아몬드 나이프로 에폭시 수지 블록을 계속 절단하여 초박형 절편(~ 70nm; 그림 1E)
      5. 후각 구덩이, 눈, 회백질 경계를 포함하여 뇌 안팎에서 쉽게 식별할 수 있는 해부학적 구조를 사용하여 초박형 절편 중에 관심 영역을 식별하고 샘플이 기울어질 때 절편 각도를 조정합니다.
      6. 단일 슬롯 L2 x 1 구리 그리드(그림 1F)에 섹션을 장착하여 그리드 바에 의해 중단되지 않고 획득할 수 있도록 합니다. Formvar 코팅 그리드를 사용하여 단면을 지지합니다.
   2. 대조
      1. 메탄올의 2% 우라닐 아세테이트로 그리드의 초박형 단면을 2분 동안 염색한 다음 Reynolds Lead citrate를 2분 더 염색합니다.

2. 이미지 획득

1. 대형 주사 투과 전자 현미경 (STEM)
   메모: 우리는 STEM 감지를 사용하여 고해상도에서 여러 개의 큰 시야를 획득할 수 있는 외부 스캔 생성기와 함께 스캐닝 EM을 사용합니다. 일반적으로 이러한 방식으로 생성된 하나의 이미지는 ~ 100개의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지의 시야와 동일하여 스티칭의 양을 크게 줄입니다.
   1. 현미경에 샘플 장착
      1. 다중 그리드 샘플 홀더에 섹션이 있는 그리드를 배치하고 SEM의 챔버로 이동합니다.
   2. STEM 검출기의 정렬
      1. 샘플이 있는 그리드를 빔 아래에 놓고 렌즈 폴에서 약 5mm 떨어지도록 위로 이동합니다. 인렌즈 검출기를 사용하여 20kV에서 이미지를 획득합니다.
      2. 그리드 가장자리에 초점을 맞추고 작동 거리를 4.0mm로 조정합니다.
      3. 샘플 홀더를 안전한 위치로 옮기고 STEM 검출기를 가져옵니다.
      4. 렌즈 내 감지기로 최대 속도로 이미징하는 동안 조정 나사를 돌려 STEM 감지기의 구멍을 이미지 필드의 중앙에 놓습니다.
      5. 렌즈 폴과 감지기 사이에 딱 맞는 샘플 홀더를 조심스럽게 다시 가져옵니다.
      6. 인렌즈 감지기로 이미지를 획득하여 단면 영역에 있는지 확인합니다.
      7. STEM 감지(게인 매체 및 모든 사분면이 '마이너스'로 설정됨)로 전환하고, 이미지를 획득하고, 스캔할 영역을 선택합니다.
      8. 가속 전압을 21kV로 올리고 빔이 안정화될 때까지 기다린 다음(다시 안정적인 이미지) 29kV 단계로 2kV로 이동합니다.
   3. 이미지 가져오기
      1. 줌아웃을 통해 샘플을 사전 조사(e-빔으로 인한 밝기 변화를 방지하기 위해)하여 스캔할 전체 영역이 이미지 창에 맞도록 합니다.
      2. 조리개를 120μm로 변경합니다(적절한 동적 범위를 유지하려면 검출기 게인을 한 단계 줄여야 함).
      3. 이미지가 흐려지도록 초점을 흐리게 합니다.
      4. 감소된 영역 스캔 옵션을 사용하여 스캔된 영역을 가능한 한 좁게 만듭니다.
      5. 프레임이 약 1 - 2초 안에 스캔되도록 스캔 속도를 설정합니다.
         메모: 크기와 조직에 따라 일반적으로 1/2시간(100 x 100μm 시야(FOV))에서 최대 3시간(1,000 x 500μm)이 소요됩니다.
      6. 최소 100배 확대하고 10초 동안 작은 영역을 스캔합니다.
         메모: 이 영역이 주변과 비교하여 밝기가 변하지 않으면 사전 조사로 충분합니다.
      7. 30μm 조리개(및 매체의 경우 STEM 게인)를 다시 가져옵니다.
      8. 샘플에 초점을 맞춥니다.
      9. 워블러를 사용하여 조리개를 정렬합니다(~ 40,000X 배율에서).
      10. 초점이 맞춰진 상태에서 가장 밝은 영역/기능을 선택하고 세부 사항이 보이도록 스캔 속도를 설정합니다.
      11. 현미경 소프트웨어에서 히스토그램을 주의 깊게 관찰하여 밝기와 대비를 조정하여 모든 픽셀을 동적 범위로 유지합니다. 가장 어두운 영역/기능에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
      12. 밝은 부분으로 돌아가서 다시 확인하십시오. 히스토그램의 양쪽에 약간의 공간이 있도록 안전한 편에 서십시오.
      13. 스캔할 전체 영역이 이미징 창에 맞도록 축소하고 넓은 영역 획득 프로그램을 시작합니다.
      14. 마법사 옵션을 사용하여 화면에서 영역을 선택하여 모자이크를 설정합니다. 필요한 세부 사항에 따라 픽셀 크기 2 - 5 nm를 사용하십시오. STEM에 체류 시간 3μs를 사용합니다.
      15. "이전 타일에 자동 초점" 옵션을 선택하고, 기본 회사 설정으로 대규모 획득 소프트웨어 자동 초점을 사용하고, "실행 전 설정 확인" 상자를 선택하고 데이터를 저장할 위치를 정의합니다.
      16. "최적화"를 눌러 현미경 설정을 확인하십시오.
          메모: 이제 필요한 시간이 표시됩니다. 이것은 1 x 0.5mm 영역의 경우 최대 72시간일 수 있습니다.
      17. 창에서 "최대 타일 해상도"는 20,000을 입력하여 개별 타일이 20k x 20k보다 크지 않도록 하여 무딘 가장자리 효과를 방지합니다. "실행"을 누릅니다.
      18. 초점과 밝기/대비(B/C) 확인을 요청하면 외부 스캔 생성기를 끄고 현미경 소프트웨어에서 초점과 난시를 조심스럽게 조정하십시오. B/C.
          를 변경하지 마십시오. 메모: 스테이지를 이동하고 배율을 변경할 수 있지만 배율을 원하는 픽셀 크기로 다시 설정해야 합니다.
      19. 외부 스캔 생성기를 다시 켜고 "계속"을 누릅니다.

결과

그림 1: 제브라피시 뇌에 대한 대규모 조직 전자 현미경의 작업 흐름. (가)생후 7일 된 제브라피시 유충. (B) 제브라피시 유충 머리가 에폭시 수지에 나란히 박혀 있습니다. (C) 표본의 반박형 절편 및 방향 지정을 위한 유리 나이프. (D) 두 개의 나란히 박힌 제브라피쉬 유충을 보여주는 대표적인 반박형 톨루이딘 블루 염색 절편. (E) 초박형(70nm) 절편을 절단하기 위한 다이아몬드 나이프. (F) 위치를 표시하기 위해 원 홀 그리드의 전체 제브라피시 유충 뇌 단면도를 편집한 이미지. ( G) 본 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
화학 물질
낮은 융점 아가로스	폭스바겐	444152지
트리카인	시그마	E10521
트리톤-X-100	시그마	엑스100
글루타르알데히드	폴리사이언스	1909
카코딜산나트륨	시그마	C0250
오스뮴테트록사이드	전자 현미경 과학	19114
칼륨페로시아나이드 (K4[Fe(CN)]6)	머 크	4984
에탄올	폭스바겐	제20821.365
우라닐 아세테이트	머 크	8473
나트륨테트라보레이트	머 크	1063808
톨두이덴 블루	머 크	1273
베이직 푹신	증권 시세 표시기	340324
구연산납	증권 시세 표시기	중단
에폰
2-도데세닐숙신산 무수물	세르바	20755
메틸나딕 무수물	세르바	29452
글리시드 에테르 100	세르바	21045
DMP-30	폴리사이언스	553
표준 평면 임베딩 몰드	전자 현미경 과학	70901
다이아몬드 나이프	주식회사 다이아톰
구리 그리드	전자 현미경 과학
양면 탄소 테이프	전자 현미경 과학
EM Zeiss Supra55 스캔	자이스
초박박절편기 Leica EM UC7	라이카
Atlas 외부 스캔 발생기	피빅스

년 년 년 호 년 년 년 년 년 시리즈 의