방법 논문

인간 배아 줄기세포(human embryonic stem cells)를 신경 오가노이드(Neural Organoids)로 분화하고 성숙시키다

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Cosset, E., et al. 뇌암 및 신경 퇴행성 질환 연구를 위한 인간 신경 오가노이드. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 인간 배아 줄기 세포를 신경 오가노이드로 만드는 단계적 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 신경 로제트 형성을 유도한 다음 조절된 성숙 및 소수성 막에서 최종 배양하여 완전히 발달된 신경 오가노이드를 달성하는 것을 포함합니다.

프로토콜

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1. 미분화 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 유지 및 배양

  1. 특정 세포외 기질로 접시를 사전 코팅하여 피더가 없는 조건에서 hSEC의 유지 관리 및 확장을 수행합니다.
    1. 300 μL의 세포외 기질이 4°C(일반적인 농도 18-22 mg/mL, 얼음에 보관)에서 해동하고 15 mL의 차가운 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지와 부드럽게 혼합하여 세포외 기질의 조기 겔화를 방지합니다. 7.5mL의 세포외 기질을 두 T150 플라스크에 추가합니다.
    2. 세포외 기질로 코팅된 접시를 37°C에서 최소 1시간(최대 하룻밤) 동안 배양합니다.
    3. 배지를 제거하고 hESC를 6.5 x 104 cell/cm2의 밀도로 시드합니다.
  2. hESC 배지에서 H1(hESC 세포주) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 유지합니다.
  3. 효소 절차를 통해 세포를 통과시킵니다: 37°C에서 1-2분에 걸쳐 T75 cm2 플라스크에 7.5mL의 효소 용액을 추가합니다. 세포가 완전히 분리되면 DMEM-F12 7.5mL를 첨가한 다음 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 더 나은 생존을 위해 Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제(10μM)가 포함된 동일한 배지에서 24시간 동안 원하는 밀도로 세포를 세포 외 기질로 코팅된 접시에 다시 플레이트합니다.

2. hESC 유래 신경 오가노이드

  1. 3D 배양을 시작하기 24시간 전에 hESC 배지를 10μM ROCK 억제제가 보충된 무혈청 배지로 교체합니다(두 성분 모두 마이크로웰 플레이트의 응집 단계 동안 세포 생존 및 자발적 신경구 형성을 지원하는 데 필요함). 세포는 60% 밀도에 있어야 합니다. 다음날(0일), hESC 집락을 단일 세포로 분리: 배지를 제거하고 Ca2+/Mg2+가 없는 PBS로 헹구고 효소 용해 용액 5mL를 추가하고 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
  2. 10μM의 ROCK 억제제가 보충된 무혈청 배지에서 세포를 수집하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 10μM의 ROCK 억제제가 보충된 10mL의 무혈청 배지에서 세포를 계수합니다.
  3. 이와 동시에 웰당 2mL의 무혈청 배지로 마이크로웰 플레이트를 헹구고 1200 x g에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하여 신경구 형성을 방지할 수 있는 모든 기포를 제거합니다.
  4. 10μM ROCK 억제제가 보충된 12.5mL의 무혈청 배지에 28.2 x 106개의 세포를 준비합니다. 1000 cells/microwell를 분배합니다. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 하룻밤(최대 36시간) 동안 놓습니다. 예를 들어, 30개의 인간 신경 오가노이드를 얻으려면 컨플루언스의 70%-80%(약 3,000만 개의 세포)에서 하나의 T150 플라스크를 사용합니다.
  5. 다음 날(1일차)에 구체(P1000 포함)를 모아 6웰 플레이트에 넣습니다. 각 웰에 B27 배지 2mL와 DMEM-F12 GlutaMAX 및 Neurobasal 배지(1:1 혼합)와 함께 1% B27 보충제와 1% 비필수 아미노산(NEAA)을 추가합니다. 빠른 신경 유도를 촉진하기 위해 10μM TGFβ(Transforming Growth Factor-beta)/Activin/Nodal 억제제와 0.5μM 뼈 형태 단백질(BMP) 억제제로 구성된 이중 SMAD(Sma 및 Mad 관련 단백질) 억제 칵테일을 배지에 보충합니다. 이 단계부터 구체는 회전(60rpm, 오비탈 셰이커)으로 배양됩니다. 회전은 구가 서로 달라붙거나 플레이트에 달라붙는 것을 방지하는 데 중요합니다.
  6. 2-3일마다 배지 교체: 플레이트를 구부리고 구체를 5분 동안 아래로 내리고 배지의 절반(2mL)을 제거하고 성장 인자와 억제제가 보충된 새로운 B27 배지 2mL를 추가합니다. 구체를 원심분리하지 마십시오.
  7. 다음 시간 경과에 따라 신경 유도를 수행합니다.
    1. 1-4일차부터 이중 SMAD가 보충된 B27 배지에서 구체를 배양합니다. 이중 SMAD 억제 칵테일(10 μM TGFβ/Activin/Nodal 억제제 및 0.5 μM BMP 억제제)은 신경 유도를 촉진합니다.
    2. 4-11일차에 이중 SMAD 칵테일을 보충한 B27 배지에 10ng/mL 표피 성장 인자(EGF) 및 10ng/mL 염기성 섬유아세포 인자(bFGF)를 첨가하여 hESC 유래 신경 로제트의 증식을 촉진합니다.
      메모: 11일째에는 대부분의 세포가 Nestin에 대해 양성이어야 합니다.
    3. 11-13일째부터 0.5μM BMP 억제제가 보충된 B27 배지에서 구체를 배양합니다.
    4. 13-21일째에 10ng/mL 신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF), 10ng/mL 뇌유래신경영양인자(BDNF) 및 1μM의 γ-세크레타제 억제제가 보충된 B27 배지에서 구체를 배양합니다. GDNF와 BDNF는 신경 세포와 신경교세포의 분화를 촉진합니다. γ-secretase 억제제는 신경 성숙을 촉진합니다.
    5. 21일차에는 6개의 웰 플레이트용으로 설계된 배양 플레이트 인서트에 증착된 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인(직경 6mm, 0.4μm)에 구체(약 1,000개 구체)를 플레이트합니다. 이 단계에서 회전을 중지합니다. 명시야 현미경으로 관찰된 로제트의 존재는 신경 분화의 시작을 나타냅니다. 신경 로제트는 PTFE 멤브레인에 구를 도금한 후 2-3일 후에 관찰할 수 있습니다.
    6. 성장 인자 및 억제제(아래 참조)가 보충된 B27 배지 1mL를 멤브레인 삽입물 아래의 각 웰에 2-3일마다(보통 월요일, 수요일 및 금요일) 첨가하여 다음 3주 동안 분화합니다.
    7. 21-25일째에 동일한 신경 성숙 배지에서 인간 신경 오가노이드를 배양합니다.
    8. 25-28일째에는 B27 배지를 1μM γ-세크레타제 억제제로만 보완합니다.
    9. 28-39일째에는 γ-secretase 억제제 추가를 중단하고 B27 배지에서만 인간 신경 오가노이드 배양을 계속합니다.
      메모: 3주 후, 신경 오가노이드는 GIC 이식에 사용할 준비가 됩니다. 신경 성숙에 따라 신경 미성숙 마커 Nesten의 감소와 성숙 신경 마커 β3-tubulin 및 GFAP의 증가가 관찰되었습니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6웰 플레이트(6웰 플레이트)팔콘 / 코닝전화: 07-201-588
Aggrewell 400 (마이크로웰 배양 플레이트)스템셀 기술34421
B27 보충제 (B27)생명 기술 / Invitrogen1238두 프로토콜 모두에 대해 원액 100x, 최종 용액 1x
뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)세포 안내GFH1-2두 프로토콜 모두 순수 H2O의 원액 100μg/mL, 최종 용액 20ng/mL
화합물 E a γ-세크레타제 억제제 (γ-세크레타제 억제제)칼바이오켐CAS 209986-17-4두 프로토콜(감마-세크레타제 억제제 XXI) 모두의 경우, DMSO의 원액 5mM, 최종 용액 1μM
디메틸 설폭사이드 퓨어(DMSO)시그마-알드리치C6164용제, 즉시 사용 가능한 화합물
Dulbecco의 변형 독수리 매체(DMEM)생명 기술제12491-015세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
둘베코의 변성 이글 배지 혼합물 F-12 (DMEM-F12)지브코11320033세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
EDTA 0.1 mM (EDTA)생명 기술AM9912세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)세포 안내GFH2-2두 프로토콜 모두 순수 H2O의 원액 100μg/mL, 최종 용액 20ng/mL
친수성 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인(PTFE 멤브레인)BioCell 인터페이스중단
LDN-193189 (BMP 억제제)축삭 메드켐 /Stemgen04-0072-02 /1509듀얼/Smad, DMSO의 스톡 용액 5mM, 최종 용액 0.5μM
L-글루타민(L-글루타민)지브코25030081L-글루타민(200mM), 원액 200mM, 최종 용액 2mM
마트리겔(세포외 기질)BD 바이오사이언스354277hESC 인증 매트릭스, 원액 18-22 mg/mL, 최종 용액 180-220 μg/mL
밀리셀-CM 배양판 인서트 (0.4 μm) (배양판 인서트)밀리포어PICM03050
Monoclonal Anti-β-Tubulin III 항체시그마T86601/1000 희석
MS 오비탈 쉐이커, MS-NOR-30 (오비탈 쉐이커)주요과학MS-NRC-30
Neurobasal (뉴로비저스)생명 기술 / Gibco21103049유지 및 성숙 배아 신경 세포 집단, 즉시 사용 가능
비필수 아미노산(NEAA)지브코11140비필수 아미노산 100X, 원액 100X, 최종 용액 1x
Nurr1 항체 (M-196)산타 크루즈사우스캐롤라이나-55681/100 희석
영양 줄기 (hESC 배지)생물 산업05-100-1ᄀ바로 사용 가능한 줄기 세포 배지
페니실린 / 스트렙토마이신 (Penicilin / Streptomycin )생명 기술 / Gibco15140122세포 배양의 경우, 원액 5 mg/mL, 최종 용액 50 μg/mL
Ca2+/Mg2+ 없는 인산염 완충 식염수 (Ca2+/Mg2+ 없는 PBS)생명 기술14190250세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK)Abcam 생화학 물질AB120129-1암석 억제제, DMSO의 원액 50mM, 최종 용액 10μM
SB-431542 (TGFβ/액티브빈/결절억제제)상승애스크- 163Dual-Smad, DMSO의 스톡 용액 50mM, 최종 용액 10μM
StemPro Accutase(hESC 효소 용액)지브코A11105-01hESC 효소 솔루션, 즉시 사용 가능
T150 플라스크 (T150 플라스크)송골매08-772-1층
변형 성장 인자 베타 3 (TGFβ3)세포 안내제109-2도파민 프로토콜의 경우, 순수 에탄올에 100 μg/mL의 원액, 최종 용액 1 ng/mL
트립신 0.25%(효소액)생명 기술15050065효소 용액, 바로 사용 가능
X-vivo (무세럼 배지)론자BE04-743Q세럼 프리 미디엄, 준비 완료
년 (유한) 호 년 시리즈 년 호

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