인간 배아 줄기 세포에서 도파민 신경 세포 오가노이드 생성

초록

출처: Cosset, E. et al. 뇌암 및 신경퇴행성 질환 연구를 위한 인간 신경 오가노이드. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 파킨슨병 연구를 위한 모델을 제공하기 위해 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 도파민 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. hESC는 마이크로웰 플레이트의 신경 유도 매체에서 배양되어 3D 신경구를 형성합니다. 그런 다음 이들은 도파민 전구 뉴런으로의 분화를 촉진하기 위해 신경 유도 배지에서 배양됩니다. 뉴런의 최종 성숙은 공기-액체 계면 조건의 배양 삽입물에서 발생하여 성숙한 도파민 뉴런으로 구성된 3D 오가노이드가 생성됩니다.

프로토콜

1. 파킨슨병(PD) 연구를 위한 hESC 유래 도파민 오가노이드

1. 0일차: 2D 배양에서 hESC를 최대 60% 포화도(0일차)까지 증폭한 다음 hESC의 다능성 기능을 유지하는 데 사용되는 줄기세포 배지를 무혈청 배지로 교체합니다. 0.5μM 골형태유전단백질(BMP) 억제제와 10μM 형질전환성장인자베타(TGFβ)/활성/결절 억제제(이중 SMAD 억제 칵테일)를 배양액에 보충하여 신경 유도를 시작한 다음 10μM Rho-associated protein kinase(ROCK) 억제제를 24시간 동안 추가하여 통과 중 세포의 생존율을 높입니다.
2. 1일차: 0.5μM BMP 억제제, 10μM TGFβ/Activin/Nodal 억제제 및 10μM ROCK 억제제가 보충된 무혈청 배지 웰당 2.5mL로 마이크로웰 플레이트를 준비합니다. 신경관의 복부 패턴을 향해 세포를 지정하려면 100ng/mL 음파 고슴도치(SHH), 100ng/mL 섬유아세포 성장 인자 8(FGF8) 및 2μM 평활화 작용제를 추가합니다. 1200 x g에서 5분 동안 플레이트(매체 포함 및 세포 제외)를 원심분리하여 마이크로웰에서 기포를 제거합니다.
   1. 2D에서 신경 유도 1일 후, 배지를 제거하고 Ca²⁺/MgCl²⁺가 없는 인산염 완충 식염수(PBS)로 빠르게 세척합니다. T75cm² 플라스크에 7.5mL의 재조합 효소 용액을 첨가하여 단일 세포 현탁액에서 콜로니를 해리합니다. 37°C에서 2분 동안 배양한 다음 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM-F12) 7.5mL로 완성합니다.
   2. 세포 현탁액을 수집하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 마이크로웰 플레이트를 준비하는 데 사용된 것과 동일한 배지에서 세포를 계수합니다.
   3. 마이크로웰당 1,000개의 세포를 포함하는 신경구를 형성할 수 있는 세포 현탁액을 얻기 위해 매체 부피를 조정합니다(예: 여기에 사용된 마이크로웰 플레이트에는 웰당 4,700개의 마이크로웰이 포함되어 있음). 따라서 2.5mL의 배지에 470만 개의 세포를 준비하고 플레이트에 이미 배치된 이전의 2.5mL 배지에 추가합니다.
   4. 각 마이크로웰에 세포를 올바르게 분배하려면 플레이트를 부드럽게 흔들고 마이크로웰 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 배양하여 구를 생성합니다.
3. 2일차: 매체로 마이크로웰을 부드럽게 세척하고 구체를 수집한 다음 조직 처리된 6웰 플레이트로 이동합니다. 배지를 1% B27, 1x 비필수 아미노산(NEAA), 2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Neurobasal 배지로 교체하십시오. 또한 regionalization factors SHH, FGF8, smoothened agonist 및 dual-SMAD inhibition small molecules를 추가할 수 있습니다.
   1. 구를 37°C(60rpm, 오비탈 셰이커)에서 회전시키고, 2-3일마다 반중간으로 교체합니다.
4. 3일차: 신경 유도를 강화하고 중뇌 정체성을 가진 신경 전구 세포로 전환하려면 Wnt/β-카테닌 경로를 활성화하는 3μM 글리코겐 합성 효소 키나아제-3 베타(GSK-3β) 억제제로 배지를 보충합니다. GSK-3β 억제제를 13일째까지 배지에서 유지하십시오. 두 개의 새로운 조직 처리된 6웰 플레이트로 분할하여 웰당 구 밀도를 모두 줄이고 구 응집을 방지합니다.
   메모: 8일째에는 대부분의 세포가 Nestin에 대해 양성이어야 합니다.
5. 8일차: 신경 성숙 시작: 지역화 인자 SHH, FGF8, 평활화 작용제 및 이중 SMAD 억제 칵테일을 0.5mM 디부티릴 고리형 아데노신 일인산염(cAMP)(성숙 촉진), 히스톤 탈아세틸화효소의 20nM 억제제(세포주기 종료용), 1μM γ-세크레타제 억제제 및 성장 인자, 10ng/mL 신경교세포주 유래 신경영양인자(GDNF)로 교체, 10ng/mL 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 1ng/mL 형질전환 성장인자 β3(TGFβ3) 및 5ng/mL 섬유아세포 성장인자 20(FGF20)(둘 다 도파민[DA] 전구 생존에 유리함). 2-3일마다 매체를 교체하십시오.
6. 21일차: 신경 오가노이드 생성: 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE 멤브레인, 직경 6mm)에 공기-액체 계면 조건에서 약 100개의 신경구를 파종합니다. 멤브레인을 배양 플레이트 삽입물(0.4mm)로 옮기고 앞서 설명한 대로 신경구 분화에 사용되는 1.2mL의 신경 성숙 배지를 추가합니다.
   1. 이 단계에서 회전을 중지합니다. 필요한 차별화 시점에 도달할 때까지 2-3일마다 매체를 교체하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트(6웰 플레이트)	팔콘 / 코닝	전화: 07-201-588
Aggrewell 400 (마이크로웰 배양 플레이트)	스템셀 기술	34421
B27 보충제 (B27)	생명 기술 / Invitrogen	1238	두 프로토콜 모두에 대해 원액 100x, 최종 용액 1x
뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)	세포 안내	GFH1-2	두 프로토콜 모두 순수 H2O의 원액 100μg/mL, 최종 용액 20ng/mL
CHIR-99021 (GSK-3β 억제제)	축삭 메드켐	CT99021	도파민 프로토콜의 경우, DMSO의 원액 7.5mM, 최종 용액 3μM
화합물 E a γ-세크레타제 억제제 (γ-세크레타제 억제제)	칼바이오켐	CAS 209986-17-4	두 프로토콜(감마-세크레타제 억제제 XXI) 모두의 경우, DMSO의 원액 5mM, 최종 용액 1μM
디부티릴 사이클릭-AMP(디부티릴 cAMP)	시그마	D0627	도파민 프로토콜의 경우, DMSO의 원액 0.5M, 최종 용액 0.5mM
둘베코의 변성 이글 배지 혼합물 F-12 (DMEM-F12)	지브코	11320033	세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
EDTA 0.1 mM (EDTA)	생명 기술	AM9912	세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
섬유아세포 성장 인자 20(FGF20)	페프로텍	100-41	도파민 프로토콜의 경우, 순수 H2O에 100μg/mL 저장 용액, 최종 용액 5ng/mL
섬유아세포 성장 인자 8(FGF8)	페프로텍	제176-5	도파민 프로토콜의 경우, 순수 H2O에 100 μg/mL 원액, 100 ng/mL 최종 용액
신경교세포 유래 신경영양인자(GDNF)	세포 안내	GFH2-2	두 프로토콜 모두 순수 H2O의 원액 100μg/mL, 최종 용액 20ng/mL
친수성 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인(PTFE 멤브레인)	BioCell 인터페이스	중단
LDN-193189 (BMP 억제제)	축삭 메드켐 /Stemgen	04-0072-02 /1509	듀얼/Smad, DMSO의 스톡 용액 5mM, 최종 용액 0.5μM
L-글루타민(L-글루타민)	지브코	25030081	L-글루타민(200mM), 원액 200mM, 최종 용액 2mM
밀리셀-CM 배양판 인서트 (0.4 μm) (배양판 인서트)	밀리포어	PICM03050
MS 오비탈 쉐이커, MS-NOR-30 (오비탈 쉐이커)	주요과학	MS-NRC-30
N2 보충제 (N2)	인비트로젠	제17502-048	GIC 배양의 경우 원액 100x, 최종 용액 1x
Neurobasal (뉴로비저스)	생명 기술 / Gibco	21103049	유지 및 성숙 배아 신경 세포 집단, 즉시 사용 가능
비필수 아미노산(NEAA)	지브코	11140	비필수 아미노산 100X, 원액 100X, 최종 용액 1x
영양 줄기 (hESC 배지)	생물 산업	05-100-1ᄀ	바로 사용 가능한 줄기 세포 배지
페니실린 / 스트렙토마이신 (Penicilin / Streptomycin )	생명 기술 / Gibco	15140122	세포 배양의 경우, 원액 5 mg/mL, 최종 용액 50 μg/mL
Ca2+/Mg2+ 없는 인산염 완충 식염수(Ca2+/ Mg2+ 없는 PBS)	생명 기술	14190250	세포 배양을 위해 즉시 사용 가능
Purmorphamin(평활 작용제)	칼바이오켐	SML0868	도파민 프로토콜의 경우, DMSO의 원액 10mM, 최종 용액 2μM
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK)	Abcam 생화학 물질	AB120129-1	암석 억제제, DMSO의 원액 50mM, 최종 용액 10μM
SB-431542 (TGFβ/액티브빈/결절억제제)	상승	애스크- 163	Dual-Smad, DMSO의 스톡 용액 50mM, 최종 용액 10μM
소닉 헤지혹 (SHH)	세포 안내	사지168-5	도파민 프로토콜의 경우, 순수 H2O에 100 μg/mL 원액, 100 ng/mL 최종 용액
StemPro Accutase(hESC 효소 용액)	지브코	A11105-01	hESC 효소 솔루션, 즉시 사용 가능
T150 플라스크 (T150 플라스크)	송골매	08-772-1층
변형 성장 인자 베타 3 (TGFβ3)	세포 안내	제109-2	도파민 프로토콜의 경우, 순수 에탄올에 100 μg/mL의 원액, 최종 용액 1 ng/mL
트리코스타틴 A (히스톤 탈아세틸화효소 억제제)	시그마	T8552	도파민 프로토콜의 경우, DMSO의 원액 100μM, 최종 용액 20nM
TrypLE (재조합 효소 용액)	인비트로젠	12604021	재조합 효소 용액, 즉시 사용 가능
트립신 0.25%(효소액)	생명 기술	15050065	효소 용액, 바로 사용 가능
X-vivo (무세럼 배지)	론자	BE04-743Q	세럼 프리 배지, 바로 사용 가능

년 (유한) 년 호 년 시리즈 호 년 호