제브라피시 유충의 약물 유발 출혈 모델링

초록

출처: Crilly, S., et al. 출혈성 뇌졸중의 병리학적 결과를 연구하기 위해 제브라피시 유충 사용. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 수정된 제브라피시 배아를 실체 현미경으로 적척한 다음 콜레스테롤 합성 억제제에 노출시켜 유충에서 혈관 파열과 뇌출혈을 유발합니다. 뚜렷한 붉은 반점으로 식별할 수 있는 출혈성 유충은 이후 추가 분석을 위해 현미경으로 분리됩니다.

프로토콜

참고: 이 연구에 사용된 형질전환 계통에는 대식세포 특이적 계통 mpeg1:mCherry(사내 구축), 호중구 특이적 mpo: GFP, erythroid-specific gata1:dsRed 및 ubiq:secAnnexinV-mVenus, 야생형, 진주층(mitfa^w2/w2) 및 돌연변이(bbh^m292) 배경의 세포 사멸(사내에서 재파생)에 대한 리포터가 포함됩니다.

1. 0일차: 난자 생산 및 채취

1. 수컷 1마리와 암컷 1-2마리의 성체 제브라피시에서 생산된 번식 상자에서 자연 산란으로 인한 수정 배아를 수집합니다.
   메모: 아토르바스타틴 프로토콜의 경우, 모든 야생형/형질전환 동물을 사용할 수 있습니다. 그러나 출혈 비율은 균주마다 약간 다릅니다.
2. 표준 지침에 따라 페트리 접시 및 스테이지당 표준 E3 배아 배지에서 28°C에서 100개의 배아를 배양합니다.
3. 수정 후 ~6시간(hpf)에 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시에서 죽은 배아와 수정되지 않은 배아를 제거합니다. 그림 1은 실험 타임라인을 보여줍니다.

2. 1일차: 24 hpf에서 아토르바스타틴 투여

1. 날카롭고 초박형 해부 겸자를 사용한 아토르바스타틴 치료를 위한 탈배아. 실험에 필요한 숫자는 그에 따라 조정될 수 있습니다.
2. E3 배아 배지 30mL를 깨끗한 페트리 접시 2개에 추가합니다. 배아 100개에 접시 하나를 사용하십시오.
   메모: 플레이트가 세포 배양을 위해 설계된 경우, 이 초기 단계의 디코리온화된 제브라피시는 종종 바닥에 달라붙습니다. 이를 방지하려면 사용하기 전에 플레이트를 깨끗한 물로 철저히 헹굽니다.
3. 처리 플레이트에서 60μL의 배아 수분을 제거하고 60μL의 0.5mM 아토르바스타틴(ATV)을 추가합니다. 0.5mM 스톡 농도에서 위의 희석은 1μM의 최종 농도를 초래하여 ~20%의 비출혈 유충(ICH-) 및 ~80%의 유충 출혈(ICH+)을 초래합니다. 처리되지 않은 대조군에는 다른 플레이트를 사용합니다.
   메모: 아토르바스타틴은 증류수(3mg에서 10mL로)에 용해되어 0.5mM 원액을 만듭니다. 가용화에 시간이 걸리므로 어두운 곳에서 교반하면서 실온에서 밤새 배양하십시오. 완전한 가용화는 최대 1주일이 소요될 수 있습니다. DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하지 마십시오. 용액은 분주되어 -20°C에서 보관됩니다. 동결-해동하지 마십시오.
4. 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 물에 100개의 배아를 담아 처리 플레이트로 옮깁니다.
5. 플레이트를 28 °C에서 배양합니다 .
   메모: ICH(뇌내출혈)는 33hpf에서 48hpf 사이에서 발생합니다. 아토르바스타틴은 24시간 이상 배양해도 추가적인 발달 문제를 일으키지 않으므로 제거할 필요가 없습니다.

3. 2일차: 50 hpf에서 무형문화유산과 무형문화유산+ 개체군 분리

1. ICH+ 물고기를 ICH- 개체군에서 분리하고 쉽게 새로운 요리로 옮깁니다.
   1. 1 μM 농도에서 ATV 모델을 사용하는 경우 이 시점에서 유충의 75-100%가 출혈(ICH+)을 나타냅니다.
      메모: 유충의 반응은 균주마다 다르며, 유충이 원하는 빈도로 출혈하지 않으면 새로운 아토르바스타틴 또는 더 높은 농도의 배치를 사용하십시오. 유충이 48 hpf까지 출혈을 보이지 않으면 ICH-로 간주합니다.
   2. bbh 모델을 사용하는 경우 모든 동형접합 돌연변이는 48hpf의 출혈을 나타냅니다. 이형접합 인크로스를 사용하는 경우, ICH- 이형접합 및 야생형 형제자매를 실험을 위한 대조 동물로 사용할 수 있습니다.
2. 필요한 경우 E3 배지에 0.02% MS222를 첨가하여 유충을 마취합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 머리에 혈액이 있는지 유충을 분류하여 새로운 E3 배지로 만듭니다. 그림 2.
   참조 메모: 머리의 혈액은 전뇌, 중뇌 또는 후뇌 또는 복합적으로 나타날 수 있으며 출혈량은 동물마다 다를 수 있습니다. bbh 돌연변이에서 ICH는 종종 심각한 부종과 관련이 있으며, 이는 더 큰 머리, 더 넓은 눈 사이의 공간, 더 넓은 확산 출혈로 식별할 수 있습니다. 그러나 모든 ICH+ bbh 유충이 부종을 보이는 것은 아닙니다.

결과

그림 1 : 뇌 손상, 운동 및 신경 염증 결과를 특성화하기 위한 실험 타임라인 그래픽. ICH, 뇌내출혈; BBH, 버블헤드.

그림 2 : ICH+ 뇌출혈 표현형. 형질전환 gata1:DsRed 리포터 진주층 배경에서 유지되는 유충 ICH 표현형의 예는 수정 후 ~48시간 동안 명시야 실체 현미경(상단 패널) 및 형광(하단 패널)으로 관찰되었습니다. ICH-유충에서는 출혈이 관찰되지 않았다(왼쪽 패널). 전뇌(forebrain)와 후뇌(hindbrain)에 적...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 플레이트	시그마-알드리치	CLS3527
28 °C 인큐베이터	LMS	210
아토르바스타틴	시그마-알드리치	파자민 0001-5mg
사육 상자	Thoren Aquatics 시스템	10011
다니오비전 관찰실	놀두스	해당 없음
E3 미디엄 1x			4% 인스턴트 오션, 1L dH2O의 500μL 메틸렌 블루
EthoVision XT 소프트웨어	놀두스	버전 11
인스턴트 오션	인스턴트 오션	SS15-10 (영어
현미경	라이카	엠z95	해부 현미경
P1000 피펫	길슨	F144059M
P1000 피펫 팁	스타랩	S1122-1830
파스퇴르 피펫	스타랩	E1414-0300
페트리 접시	코 닝	101VR20
피펫보이	인테그라 바이오사이언스	피펫보이
초미세 절개 겸자	한천 과학	AGT502
Zen 소프트웨어	자이스	버전 2.3

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