신경전구세포와 뉴런에서 시알로글리코단백질의 면역형광 염색

초록

출처: Bai, Q., et al., Sialoglycan의 대사 라벨링에 의한 일차 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커 식별. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 일차 신경 줄기 및 전구 세포, 뉴런에서 변형된 시알로글리코단백질의 비오틴화(biotinylation) 및 형광 라벨링과 형광 현미경을 사용한 시각화를 보여줍니다.

프로토콜

1. 확장된 1차 NSPCs 및 분화된 뉴런에서 sialoglycoproteins의 면역

형광 염색

1. 이중 증류수에 1.5mM CuSO₄ 및 9mM BTTAA를 함유하는 BTTAA-CuSO₄ 복합체 1 30x 스톡을 준비합니다. PBS에서 50μM 비오틴-알킨, 2.5mM 아스코르브산나트륨 및 1x BTTAA-CuSO₄ 복합체를 함유하는 신선한 비오틴 접합 완충액 1을 준비합니다.
2. 공동 배양 플레이트에서 인서트를 제거합니다. 바닥 웰에서 배양 배지를 흡인하고 예열된 PBS로 신경 세포를 한 번 세척합니다.
3. 우물에서 PBS를 흡입합니다. 웰당 미리 냉각된 4% 파라포름알데히드 PBS 용액 1mL를 세포에 추가하고 10분 동안 RT에서 고정합니다. 그런 다음 미리 식힌 PBS로 세포를 3번 세척합니다.
4. 웰에서 PBS를 흡인하고 웰당 새로 준비된 비오틴 접합 완충액 1mL를 세포에 추가합니다. RT에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
5. 웰에서 반응 완충액을 흡입합니다. PBS로 세포를 3회 세척합니다. 1% FBS 및 1μg/mL Alexa Fluor 647-streptavidin이 함유된 염색 완충액을 준비합니다. 웰당 1mL의 염색 완충액을 세포에 추가하고 30분 동안 RT에서 세포를 배양합니다.
6. 웰에서 염색 완충액을 흡입하고 미리 냉각된 PBS로 세포를 3회 세척합니다. PBS에 5% BSA 및 0.3% 비이온 세제-100을 함유한 차단 버퍼를 준비합니다. 웰당 1mL의 차단 버퍼를 세포에 추가하고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
7. anti-nestin 및 anti-β-tubulin III 항체를 각각 1:20 및 1:1,000의 비율로 차단 완충액에 함께 희석하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 웰에서 차단 버퍼를 제거하고 웰당 1mL의 1차 항체 용액을 세포에 추가합니다. 세포를 4°C에서 밤새 배양합니다.
8. 웰에서 1차 항체 용액을 제거합니다. 미리 식힌 PBS로 세포를 3번 세척합니다. Alexa Fluor 488 염소 anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 546 염소 anti-mouse IgG2b 및 DAPI를 1:1,000 희석으로 차단 버퍼에 함께 희석하여 2차 항체 용액을 준비합니다. 웰에서 PBS를 흡인하고 웰당 1mL의 2차 항체 용액을 세포에 추가합니다. RT에서 2시간 동안 세포를 배양합니다.
9. 웰에서 항체 용액을 흡인하고 미리 냉각된 PBS로 세포를 3회 세척합니다. 그 후, 세포는 이미지 캡처를 할 준비가 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 태아 세럼	지브코	10099141	10%
파라포름알데히드	시그마	158127	4%
다피	지브코	62248
6웰 플레이트	코 닝	3335
마우스 단클론 항 Nestin	발달 연구 Hybridoma Bank	쥐-401	1에서 20
마우스 단클론 항베타-튜불린 III	시그마	T8860	1에서 1000
Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG1	인비트로젠	A-21121	1에서 1000
Alexa Fluor 546 염소 안티 마우스 IgG2b	인비트로젠	A-21143	1에서 1000
트리톤 X-100	암레스코	694
황산구리	시그마	209198
알킨-비오틴	화학 도구를 클릭합니다	TA105
비티타아	화학 도구를 클릭합니다	1236
아스코르브산나트륨	시그마	A4034
Alexa Flour 647-conjugated streptavidin	인비트로젠	S21374	1에서 1000

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