뉴런 성장 원뿔 붕괴에 대한 응집된 아밀로이드 β의 체외 평가

초록

출처: Kuboyama, T. 배양 마우스 뉴런에서 축삭 성장 원뿔 붕괴 및 초기 아밀로이드 β 효과 시각화. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 아밀로이드 β(Aβ) 응집체에 의한 신경 성장 원뿔 붕괴의 체외 평가를 보여줍니다. 뉴런을 Aβ 응집체로 처리하면 세포골격 불안정화가 발생하여 축삭돌기 끝에 있는 성장 원뿔이 붕괴됩니다. 성장 원뿔의 붕괴 정도를 평가하기 위해 처리된 세포를 대조 세포와 비교합니다.

프로토콜

1. 어세이 축소

1. Poly-D-lysine coating
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)에 400μL의 5μg/mL 폴리-D-라이신(PDL)을 8웰 배양 슬라이드에 코팅하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
   2. PDL 용액을 제거하고 증류수로 우물을 3회 세척합니다.
2. 뉴런 배양
   1. 배아 14일(E14) ddY(Deutschland, Denken 및 Yoken) 마우스에서 갓 분리한 대뇌 피질을 12% 말 혈청, 0.6% 포도당 및 2mM L-글루타민(배지 A)을 포함하는 뉴런 배양 배지에서 마이크로 가위로 다집니다. 항생제를 추가하지 마십시오.
      메모: 이 프로토콜에서는 ddY 마우스가 사용됩니다. 이것은 일본에서 일반적으로 사용되는 근친 교배입니다. 이 뉴런 배양 프로토콜은 쥐의 피질 뉴런에도 적용될 수 있습니다.
   2. 87 x g에서 3분 동안 조직을 원심분리합니다.
   3. 상층액을 제거합니다. 그런 다음 펠릿에 0.05% 트립신 2mL를 넣고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 5분마다 탭하여 혼합합니다.
   4. 중간 크기 A 4mL를 넣고 탭하여 섞습니다.
   5. 조직을 178 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
   6. 상층액을 제거하고 PBS에 용해된 600 U/mL 데옥시리보뉴클레아제 I(DNase I)과 0.3 mg/mL 대두 트립신 억제제로 조직을 37°C에서 15분 동안 배양합니다.5분마다 탭하여 혼합합니다.
   7. 배양 후 4mL의 배지 A를 넣고 탭하여 혼합합니다.
   8. 조직을 178 x g에서 3분 동안 원심분리합니다.
   9. 상등액을 제거한 후 4mL의 배지 A를 첨가하고 광택 처리된 파스퇴르 피펫으로 조직을 분쇄합니다.
   10. 70μm 공극 크기의 메시로 삼각화된 조직을 필터링합니다. 여과 후 혈구계로 세포의 밀도를 계산합니다.
   11. 8-well 배양 슬라이드에서 배지 A를 사용하여 0.8 x 10⁴ cells/well에서 세포를 배양하고 37°C에서 10%_CO2의 가습 분위기로_CO2 인큐베이터에서 유지합니다.
   12. 배양 4시간 후, 배양 배지를 신경 세포 배양을 위한 2% 보충제, 0.6% 포도당 및 2mM L-글루타민(배지 B)을 포함하는 것으로 교체하십시오.
       메모: 뉴런의 순도는 앞서 설명한 바와 같이 약 75%였습니다.
3. 축소 분석
   1. 시중에서 구한 전장 아밀로이드 β1-42(Aβ1-42)를 0.5mM 농도의 증류수에 용해시키고 37°C에서 7일 동안 배양합니다. 배양 후 응집된 Aβ1-42 용액을 사용할 때까지 -30°C 냉동고에 보관하십시오.
      메모: 이 배양은 Aβ의 응집 및 독성에 필요합니다.
   2. 4일간의 뉴런 배양 후 100μM의 응집된 Aβ1-42 또는 비히클 용액(증류수)을 포함하는 100μL의 새로운 배지 B로 웰을 1시간 동안 처리합니다
      메모: Aβ1-42의 효과는 용량 의존적으로 0.1에서 5μM로 증가했으며 앞서 설명한 바와 같이 0.5μM에서 최고조에 달했습니다. 신경세포 배양 3일 후 1시간 동안 Aβ1-42 처리로 유사한 결과를 관찰할 수 있습니다.
   3. 배양 배지를 제거하고 즉시 핫 플레이트에서 37 ° C에서 1 시간 동안 PBS에 4 % 자당을 함유 한 4 % 파라 포름 알데히드로 뉴런을 고정한다.
   4. 고정 후 PBS로 뉴런을 3회 세척하고 수성 장착 매체로 장착합니다. 장착 매체를 4°C에서 2-4일 동안 건조시킵니다.
   5. 도립 현미경에서 20X 건식 대물 렌즈로 각 웰의 전체 영역(7.8 x 9 mm²)을 캡처합니다.
   6. 앞서 설명한 대로 3단계 또는 4단계에 있는 각 뉴런의 가장 긴 신경돌기를 축삭
   돌기로 분류합니다.
   7. 다음 기준에 따라 성장 원뿔을 분류합니다: 1) 얇은 판자(lamellipodia)가 없는 축삭 성장 원뿔 또는 2) 3개 미만의 필로포디아(filopodia)를 가진 것은 앞에서 설명한 바와 같이 축소된 성장 원뿔로 간주됩니다.
      메모: 건강한 성장 원뿔은 0점으로 점수가 매겨집니다. 붕괴된 성장 원뿔은 1점으로 점수가 매겨집니다. 평균 붕괴 점수는 각 처리에 대해 계산됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ddY 마우스	에스엘씨
8웰 배양 슬라이드	송골매	354108
폴리 D 라이신	와코	제168-19041
배양 배지, Neurobasal 배지	지브코	제21103-049
하우스 세럼	지브코	제26050-088
포도당	와코	TEL.049-31165
L-글루타민	와코	TEL:074-00522
0.05% 트립신	지브코	제25300-054
DNase I	워 딩 턴	디피에이트
대두 트립신 억제제	지브코	제17075-029
70μm 메쉬 크기의 필터, 셀 스트레이너	송골매	352350
B-27 보충제	지브코	제17504-044
CO2 인큐베이터	아스텍	SCA-165DS
아밀로이드 β1-42	시그마-알드리치	A9810
파라포름알데히드	와코	제162-16065
자당	와코	Tel.: 196-00015
수성 마운팅 매체, AquaPoly/Mount	폴리사이언스	18606-20
도립 현미경 A	칼 자이스	악시오 옵저버 Z1	AxioCam MRm, 히팅 유닛 XL S, CO2 모듈 S1 및 TempModule S1과 연결
대물렌즈 Plan-Apochromat 20x	칼 자이스	제420650-9901

호 호 호 호 호 호 호 년 호