검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 질량 분석기 이미징(IMS)을 위한 조직 절편 준비
- 인간 부검된 뇌의 가공 조직 표본
메모: IMS에 대한 샘플 준비 단계가 조직의 원래 상태를 보존하는지 확인합니다. 오염 및 사후 변경을 피하십시오. 다음 단계가 중요합니다.
사- 후 8시간 이내에 -80°C에서 제거, 처리 및 보관된 뇌에서 IMS에 대한 인간 피질 표본을 얻습니다. 알츠하이머병(AD) 환자의 후두 피질에서 채취한 뇌 표본과 연령에 맞는 대조군을 채취합니다.
- 냉동 조직 절편의 준비
- 저온 유지 장치에서 조직 부분을 자릅니다. 전도성 인듐-주석-산화물(ITO) 코팅된 현미경 유리 슬라이드를 저온 유지 장치 내부에 놓습니다.
- 부검 뇌 표본을 저온 유지 장치 내부에서 -80°C에서 -22°C로 가열합니다.
- 모든 실험을 위해 새 일회용 블레이드를 저온 유지 장치에 부착합니다. 항상 칼날의 깨끗한 부분을 사용하십시오.
- 얼어붙은 부검 뇌를 소량의 최적 절단 온도(OCT) 화합물(스테이지 중앙 영역을 덮을 수 있을 만큼, 재료 표 참조)과 함께 스테이지에 놓습니다.
- 얇은 단면에 대한 조건을 선택합니다. IMS의 경우 인간 뇌 절편에 10–12μm의 두께를 사용합니다. IMS 및 면역조직화학(IHC)의 경우 각 조직 샘플에서 5-6개의 절편을 절단합니다.
- 칼날이 조직을 절단하기 시작하면 휠을 돌리고 모든 조직이 노출될 때까지 블록을 "향하게" 합니다. 단면을 가로질러 작은 줄무늬나 찢어짐이 있으면 온도 조절기가 자동으로 고정될 때까지 저온 유지 장치에서 조금 더 기다리십시오. 티슈 아래에 있는 안티롤을 열기 전에 몇 초간 세십시오.
- 즉시 조직 조각을 유리 슬라이드의 ITO 코팅면에 놓습니다. ITO 코팅되지 않은 면의 슬라이드 아래에 손가락을 넣어 조직 조각을 해동합니다. 조직이 슬라이드에 달라붙습니다. 조직이 주름 없이 가능한 한 평평한지 확인하십시오. 실온에서 이 단계를 수행합니다.
메모: 장갑, 마스크 및 실험 가운을 착용하십시오. 인간 샘플에는 생물학적 오염 물질이 포함되어 있을 수 있습니다. 하루 동안 모든 절편을 만들었으면 실험실 물티슈와 100% 에탄올 200mL로 저온 유지 장치, 브러시 및 척을 청소합니다.
- 조직 부분을 헹구기
- 샘플을 40-100mL의 70% 에탄올에 30초 동안 담가 내인성 지질과 무기염을 제거합니다. 유리 염색 용기를 사용하십시오.
- 100% 에탄올 40-100mL로 30초, Carnoy's 용액 40-100mL로 3분, 100% 에탄올 40-100mL로 30초, 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 40-100mL로 1분, 100% 에탄올 40-100mL로 30초 동안 샘플을 세척합니다.유리 염색 용기를 사용합니다.
메모: Carnoy의 용액은 에탄올 6부, 아세트산 3부, 클로로포름 1부로 구성된 정착제입니다.
- 진공 상태에서 30분 동안 건조시킵니다.
- 부검 뇌 조직에서 Aβ 단백질의 더 나은 이온화를 위해 포름산 증기로 조직 절편을 처리합니다.
- 100% 포름산 5mL로 후속 기화에 사용할 오븐과 배양 유리 슬라이드를 준비합니다. 만족스러운 산 처리를 달성하려면 이 단계 전체에서 인큐베이션 유리 접시의 공기 습도를 포화 수준으로 유지하고 온도를 60°C로 유지하십시오. 포름산에 담그지 않도록 하면서 인큐베이션 유리 접시에 조직 슬라이드를 놓고 6분 동안 처리합니다.
- 필름 스캐너, 젤 스캐너 또는 디지털 현미경 등을 사용하여 샘플의 광학 이미지를 촬영합니다. 실온에서 이 단계를 수행합니다. 샘플의 광학 이미지 정렬은 샘플 타겟이 기기 내부에 배치될 때 필요합니다. 일반적으로 매트릭스 층 아래의 조직 섹션을 인식할 수 없습니다.
참고: 광학 이미지를 촬영하는 가장 편리한 방법은 사무용 스캐너를 사용하는 것입니다. 이미징 데이터 저장 폴더에 이미지를 저장하는 것이 좋습니다.
- 광학 이미지를 샘플과 연관시키려면 광학 이미지와 카메라 광학 장치의 매트릭스 레이어 아래에서 모두 볼 수 있는 가이드 마크를 만드십시오. 가장 쉬운 방법은 광학 이미지를 촬영하기 전에 샘플 주변에 최소 3개의 수정액 표시를 발견하는 것입니다.
- 매트릭스 적용
- 매트릭스 용액의 준비
- 유기 용매 내성 마이크로튜브에서 50% 아세토니트릴(ACN) 및 0.1% TFA에 10mg/mL 시나핀산(SA) 용액을 준비합니다. 10 분 동안 와류 또는 짧은 초음파 처리로 SA 화합물을 완전히 용해시킵니다. 사용할 때까지 용액을 실온에 보관하십시오.
알림: 매트릭스 스프레이에는 에어 브러시, 초음파 분무기 또는 자동 분무기를 사용하는 세 가지 옵션이 있습니다.
- 매트릭스에 에어브러시 분사
- 일정한 실내 온도(20–23 °C)와 습도(40%–60%)에서 작업을 수행하십시오. 최적의 분무를 위해 조정해야 하는 매개변수에는 액적의 크기, 미스트의 양, 스프레이 노즐과 조직 섹션 사이의 각도 및 거리, 실험실 온도 및 습도가 포함됩니다. 현미경 검사 결과를 확인하여 이러한 조건을 조정합니다.
메모: 제한 요인에는 결정 크기와 매트릭스 적용 범위의 균질성, 분석물의 바람직하지 않은 이동/확산이 포함되므로 입자 크기는 작을수록 좋습니다. 균질성도 검사 포인트입니다.
- 매트릭스에 초음파 분무기 분사
- 데시케이터에서 분사할 티슈를 제거하고 챔버에 넣습니다. 티슈가 센서 창을 덮고 있지 않은지 확인하십시오.
- 시작 버튼을 눌러 준비를 시작합니다. 일반적으로 준비 시간은 약 90분 정도입니다. 준비는 매트릭스 층의 두께와 습윤 모니터링을 통해 자동으로 조절됩니다. 준비가 완료되면 슬라이드를 제거하고 MALDI 기기에서 읽기 전에 데시케이터에 15분 동안 보관하십시오.
- 스프레이 헤드가 깨끗해 보일 때까지 2-3mL의 100% 메탄올(MeOH)로 분무기를 청소합니다.
메모: 매트릭스 방울의 미세한 미스트는 중력 시트에 의해 조직 안으로 가라앉을 수 있습니다. 20μm의 평균 액적 크기가 생성됩니다. 모든 액적 직경은 50μm 미만입니다.
- 매트릭스에 자동 분무기 분사
- 매트릭스 용액을 자동 분무기로 조직 표면에 분사합니다. 가열된 피복 가스(N2, 10psi 및 75°C로 설정)의 일정한 흐름이 매트릭스 용액 스프레이와 함께 전달됩니다. 용매 펌프 시스템(10psi 및 0.15mL/분으로 설정)을 사용하여 매트릭스 용액을 제공합니다.
메모: 가장 중요한 것은 매트릭스 에어로졸 흡입을 피하기 위해 안전 캐비닛 아래에서 작업하는 것입니다. 실내 온도와 습도를 제어하여 균일한 매트릭스 결정화를 재현합니다.
2. 말디-IMS
- 초고속 질량 분석법을 수행합니다.
- 10kHz 네오디뮴 도핑 이트륨 알루미늄 가넷(Nd:YAG, 355nm) 레이저가 장착된 MALDI-IMS를 사용하여 고처리량 및 고공간 해상도 이미징 실험을 수행할
수 있습니다.
- 질량 분석법 측정의 경우 MALDI 제어 소프트웨어 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 조직 영역을 정의합니다.
- 질량 범위가 m/z 2,000–20,000이고 공간 분해능이 20 및 100μm인 양의 선형 모드에서 스펙트럼을 획득합니다.
- 검량 표준물질을 만들려면 펩타이드 검량 표준물질과 단백질 검량 표준물질을 TA30 용액(ACN:0.1% TFA = 30:70)에 알파-시아노-4-하이드록실-신남산(CHCA)과 1:4 비율로 용해한 다음 10배 희석합니다. 1μL의 검량 표준물질을 4개의 다른 위치에 있는 슬라이드에 놓습니다.
- 분자 조직학 소프트웨어(Table of Materials를 참조하십시오)를 사용하여 여러 개의 단일 이미지를 오버레이하여 노인 플라크(SP) 및 동맥 벽에서 공동 국소화되는 다양한 Aβ 펩타이드와 같은 다양한 신호의 공간 상관 관계를 찾습니다.
