동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 재료
- 지질다당류(LPS) 주사의 준비
- Salmonella typhimurium에서 추출한 LPS 분말 25mg에 증류수 25mL를 최종 농도 1mg/mL까지 추가합니다. 주사를 4°C의 멸균 튜브에 보관하십시오.
주의: LPS는 독성이 있습니다.
- EB 주입을 작업 농도로 유지하기 위해 일반 0.9% 식염수에 2% Evans blue(EB) 용액을 준비합니다.
2. 동물
복강내 주사로 10주령(평균 체중: 280 ± 20g)의 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐에게 LPS를 투여합니다.
주의: 다른 조직에서 쥐를 구입하는 경우 적응 단계는 7일 이상이어야 합니다.
3. LPS 주입
- 각 쥐에게 1mg/kg의 용량으로 복강내 LPS를 주입하고 쥐를 집 우리로 되돌립니다.
메모: 마취는 필요하지 않습니다.
- 6 시간 후, 쥐에게 동일한 용량의 LPS 주사를 주입합니다.
- 16시간 후 동일한 용량의 LPS를 쥐에게 주입합니다.
주의: SD 랫트에 1mg/kg의 용량으로 LPS를 주입하면 5%의 폐사율이 발생할 수 있습니다. 사망률은 젊거나 나이가 많은 쥐 또는 임신한 암컷 쥐에서 더 증가할 수 있습니다.
- LPS 주입 후 쥐를 우리로 되돌리고 음식과 음료에 대한 임시방편을 제공합니다.
메모: 쥐는 뚜렷한 전신 염증 반응을 보이므로 실험 내내 케이지를 깨끗하게 유지하는 것이 중요합니다. 쥐는 첫 번째 LPS 주입 후 체중, 일반적인 외모 및 태도를 자주(2회) 모니터링해야 합니다. 쥐가 구부정한 자세를 보이기 시작하고, 움직이기를 꺼리고, 상당한 체중 감소(>20%)를 보이며, 포르피린이 염색되어 7일간의 EB 연구 종료 시점 전에 인도적으로 안락사됩니다.
4. 샘플 수집
- EB 주입
- 첫 번째 주사 후 7일 후에 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 랫드를 복강내로 마취합니다.
- 쥐가 각막 반사 반응을 보이지 않을 때까지 1-2분 동안 기다립니다. 각 쥐에 대해 5-8mm 깊이의 심장 천자를 수행합니다. 천자 지점은 3번째 및 4번째 늑간 공간에서 흉골의 왼쪽 가장자리에서 5mm 떨어져 있어야 합니다.
- 혈액 회복이 관찰될 때까지 기다렸다가 체중 0.2mL/체중 100g의 용량으로 EB를 좌심심실에 주사합니다.
주의: 심장 천자와 EB 주사는 신중하게 수행해야 합니다. EB는 좌심실 대신 흉강이나 심낭에 주입할 수 있습니다.
- 빈 튜브로 다시 빨아들이고 주입 전에 이 부피를 EB 튜브로 교체하여 실패율을 줄이는 데 도움이 됩니다(예: 실수로 흉곽에 주입).
- 쥐를 10분 동안 누운 자세로 유지합니다.
참고: 면역형광 영상에서 EB 누출을 감지하는 데 샘플을 사용하지 않는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
- 총체적인 관찰
- 얼음처럼 차가운 1M 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 심장 관류를 수행하여 뇌 혈관 구조와 뇌를 청소합니다.
- 메스를 사용하여 횡격막 전체에 걸쳐 복부를 절개합니다.
- 흉곽 정중선 바로 왼쪽의 갈비뼈를 자릅니다.
- 흉강을 엽니다. 클램프를 사용하여 심장을 노출시키고 혈액 및 기타 체액의 배출을 용이하게 합니다.
- 겸자로 심장을 꾸준히 잡으면서(심장은 여전히 박동하고 있어야 함) 좌심실의 돌출부에 바늘을 직접 삽입하여 약 5mm까지 연장합니다.진입점 근처에서 클램핑하여 해당 위치에 바늘을 고정합니다.
주의: 바늘은 내부 벽을 뚫고 용액의 순환을 손상시킬 수 있으므로 바늘을 과도하게 늘리지 마십시오.
- 밸브를 해제하여 관류 펌프를 사용하여 약 20mL/분의 속도로 느리고 일정한 속도로 얼음처럼 차가운 PBS 용액(200–300mL)이 흐르도록 합니다. 동물이 총체적인 관찰 대신 고정이 필요한 경우 동일한 용량의 얼음처럼 차가운 0.9% 식염수를 사용하십시오.
- 날카로운 가위를 사용하여 심방을 절개하여 용액이 계속 흐르도록 합니다. 액체가 자유롭게 흐르지 않거나 동물의 콧구멍이나 입에서 나오는 경우 바늘의 위치를 조정하십시오.
- 총 관찰에 의한 CMH 스크린.
메모: 총 관측치에 의한 CMH 수를 계산하는 데 표본이 사용되지 않는 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다.
- 고정
- 얼음처럼 차가운 0.9% 식염수(200–300mL)를 사용하여 심장 관류를 수행하여 뇌 혈관 구조와 뇌를 청소합니다.
- 고정을 위해 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드를 사용하여 심장 관류를 수행합니다.
- 쥐의 목을 베고, 뇌를 분리하고, 뇌를 20% 자당 용액에 최소 6시간 동안 담그십시오.
- 용액을 30 % 자당으로 변경하고 6 시간 더 고정하십시오.
- 저온 유지 장치를 사용하여 10mm 두께의 뇌 조직 절편을 준비합니다.
5. 헤마톡실린 및 에오신 (HE) 염색
참고: 이 절차는 HE 염색 키트를 사용하여 수행됩니다.
- 슬라이드를 증류수로 씻으십시오.
- 헤마톡실린 용액에 8분 동안 염색합니다. 흐르는 수돗물에 5분 동안 씻습니다.
- 1% 산성 알코올을 30초 동안 구별합니다. 흐르는 수돗물에 1분 동안 씻습니다.
- 0.2% 암모니아수(블루잉) 또는 포화 탄산리튬 용액에 30초에서 1분 동안 염색하고 흐르는 수돗물에 5분 동안 세척합니다.
- 95% 알코올(10딥)로 헹굽니다.
- 에오신 용액으로 30초에서 1분 동안 카운터 스테인합니다.
- 95% 알코올을 통해 탈수하고 절대 알코올을 두 번 변경하여 각각 5분 동안 합니다.
- 크실렌에서 30초 동안 클리어합니다.
- Liu의 방법을 사용하여 마운트합니다.
- 명시야 형광 현미경을 사용하여 분석합니다.
메모: CMH의 구성 요소인 혈관에서 방출된 적혈구는 HE 염색 아래에서 적색-주황색으로 나타납니다.
