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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 1차 해마 세포 배양
- 배아 19일에 쥐 해마의 해리된 세포 배양을 준비합니다. 폴리에틸렌이민(PEI)으로 코팅된 12mm 커버슬립에 50,000 - 60,000 cells/well의 밀도로 24웰 접시에 셀을 플레이트링합니다. 세포 계수 챔버와 위상차 광학 장치를 사용하여 밀도를 확인합니다.
- 3 일 (시험관 내 (DIV) 3) 동안 인큐베이터의 24 웰 플레이트에서 37 % CO2로 뉴런을 배양합니다.
- 투과광 현미경을 사용하여 세포 건강 지표에 대한 커버슬립을 평가합니다(예: 10 - 20X 배율의 위상차 광학 장치). 다음과 같은 건강 상태 지표를 확인하십시오: 명확한 위상 대비 후광, 구슬 구조가 없는 신경돌기, 소마 클러스터링 또는 신경돌기 번들링 없음.
2. 형질주입
참고: 다음 프로토콜은 3개의 웰에 대한 이중 transfection을 나타냅니다. 그러나 프로토콜은 4개의 웰에 충분한 양이 준비될 때 가장 잘 작동합니다.
- 삼각 플라스크에 500mL의 트랜스펙션 완충액(274mM 염화나트륨, NaCl, 10mM 염화칼륨, KCl, 1.4mM 인산수소나트륨, Na2 HPO4, 15mM 포도당, 42mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, HEPES)을 준비합니다.
- 삼각 플라스크에 NaCl 8.0g, KCl 0.37g, Na2HPO4 0.095g, 포도당 1.35g 및 HEPES 5.0g을 400mL의 증류수에 용해시킵니다.
- pH 측정기를 사용하여 1M 수산화나트륨, NaOH로 pH를 6.95로 조정합니다.
- 증류수의 부피를 500mL로 조정하고 pH 측정기를 사용하여 pH를 확인합니다.
- 1 M NaOH를 transfection buffer에 피펫팅하여 pH 값으로 20 - 30 mL의 transfection buffer 분취량을 만듭니다: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
참고: transfection buffer의 pH는 transfection 효능에 매우 중요합니다.
- 어떤 transfection buffer가 가장 많은 수의 transfection된 세포를 생성하는지 테스트하려면 각 pH 값을 6.96에서 7.11 사이로 테스트합니다. 2.2 - 2.11에 설명된 transfection 방법과 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 검증된 플라스미드를 사용합니다. 모든 transfection buffer pH 값에 대해 coverslip당 transfection된 세포의 수를 측정하여 어떤 buffer가 가장 효과적인지 평가합니다.
- transfection 효율이 가장 높은 버퍼를 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다.튜브를 -20°C에서 동결 및 보관합니다.
- 환원된 혈청 배지, 세포 배양 배지 및 증류수를 수조에서 37°C로 예열합니다.
- 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다. 멸균 작업 조건을 보장하기 위해 층류 후드 아래에서 작업하십시오.
- 7.5 μL의 2 M 염화칼슘을 각 내독소가 없는 DNA 4 μg(Synaptophysin-mOrange 및 mGFP/GFP-Rogdi)과 혼합합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 총 부피가 60μL에 도달하도록 물을 추가합니다.
- 60μL의 트랜스펙션 완충액을 혼합물에 추가합니다. 최상의 결과를 얻으려면 와류에서 DNA-mix를 부드럽게 흔들면서 transfection buffer를 적반으로 추가합니다.
- 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다. 배양 시간 동안 배양 튜브를 층류 후드 옆에 튜브를 놓아 흔들지 마십시오.
- 층류 후드 아래에서 1000μL 피펫을 사용하여 웰에서 세포 배양 배지("컨디셔닝 배지")를 제거하고 인큐베이터의 별도 용기에 보관합니다.
- 각 웰에 500μL의 환원된 혈청 배지를 추가합니다. 20분 배양 기간(단계 2.3.3)이 끝날 때까지 37°C 및 5%CO2에서 세포를 배양합니다.
- 여러 방울을 피펫팅하여 각 웰에 30μL의 transfection mix를 추가합니다. 튜브 바닥에 잔여물을 버리십시오.
- 모든 웰에 transfection mix가 공급된 후 24-well 플레이트를 부드럽게 흔들어 medium에서 transfection mix가 분포되도록 합니다.
- 37 ° C 및 5 % CO2에서 60 분 동안 웰을 배양합니다.
- transfection mix를 제거 및 폐기하고 세포 배양 배지로 3회 세척합니다. 각 웰에 1mL의 세포 배양 배지를 추가하고 RT에서 30초 동안 배양합니다. 750μL의 배지를 제거하고 동일한 양의 새 배지를 추가합니다. 이 작업을 세 번 반복합니다.
알림: 세탁 단계가 중요합니다. 각 웰에 매체가 없는 시간을 최소한으로 유지하고(즉, 웰별로 제거 및 교체) 세척 매체를 부드럽게 추가합니다.
- 세포 배양 배지를 제거 및 폐기하고 컨디셔닝된 배지 450μL를 웰별로 첨가합니다.
- 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2 to DIV 10에서 뉴런을 성숙시킵니다.
3. 자극 및 Syt1 흡수
참고: 다음 프로토콜은 3개의 웰에 흡수를 적용합니다. 다른 수의 우물의 탈분극을 위해 그에 따라 양을 조정하십시오.
- 삼각 플라스크에 50mL의 10x 탈분극 완충액(640mM NaCl, 700mM KCl, 10mM 염화마그네슘, MgCl2, 20mM 염화칼슘, CaCl2, 300mM 포도당, 200mM HEPES, pH 7.4)을 준비합니다.
참고: 탈분극 버퍼는 몇 주 동안 4°C에서 유지할 수 있습니다. 비탈분극 용액도 사용하는 경우, 자극 유발 재활용과 자연 재활용을 비교하기 위해 1290mM NaCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 20mM CaCl2, 300mM 포도당, 200mM HEPES pH 7.4로 구성된 10x Tyrode 용액을 준비합니다. 1x로 희석한 후 사용하기 전에 1μM의 테트로도톡신을 첨가하여 활동전위 생성을 차단합니다.
- NaCl 1.87g, KCl 2.61g, MgCl2-6H 2O0.1g, CaCl2-2H 2O0.15g 및 포도당 -1H2O3.0g 및 HEPES 2.38g을 삼각 플라스크 50mL에 용해시킵니다. NaOH로 pH를 조정하고 용액을 멸균 여과합니다. 버퍼를 증류수에 1:10으로 희석하여 1x 농도를 얻습니다.
- 자극 후 고정을 위해 4x 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)에 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
- 1x PBS에 4% PFA 500mL를 넣고 파라포름알데히드 20g을 증류된 H2O.
450mL에 용해시킵니다.
알림: 용액을 가열하면 용해 속도가 빨라질 수 있지만 PFA가 분해될 수 있으므로 용액을 70°C 이상으로 가열하지 마십시오.
주의: PFA는 독성이 있고 발암성이 있으며 기형을 유발할 수 있습니다. PFA로 작업할 때는 장갑을 착용하고, 흄 후드 아래에서 작업하고, 섭취를 피하십시오.
- 용액을 RT로 식히고 10x PBS 원액 50mL를 추가합니다. pH 측정기를 사용하여 NaOH/HCl(염산)로 pH를 7.4로 조정합니다.
- 600 μL의 1x 탈분극 완충액과 10 mL의 세포 배양 배지를 수조에서 37 °C로 예열합니다.
- 1μL의 마우스 anti-Syt1 항체(클론 604.2)를 1x 탈분극 완충액에 추가하고 10초 동안 와류(vortex)합니다.
- 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 폐기합니다. 각 웰에 탈분극-항체 혼합물 200μL를 추가하고 인큐베이터에서 37°C 및 5% CO2에서 5분 동안 배양합니다.
- 탈분극-항체 혼합물을 제거 및 폐기하고 세포 배양 배지로 3회 세척합니다. 각 웰에 1mL의 세포 배양 배지를 추가하고 RT에서 30초 동안 배양합니다. 750μL의 배지를 제거하고 동일한 양의 새 배지를 추가합니다. 세 번 반복합니다.
- 세포 배양 배지를 제거 및 폐기하고 1x PBS에 300μL의 4% PFA를 첨가합니다. 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.
- PBS 1개로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
4. 면역세포화학
- 블로킹 버퍼 50mL를 준비합니다.
참고: 차단 버퍼는 몇 달 동안 -20°C에서 유지할 수 있습니다.
- 자당 2.5g과 소 혈청 알부민(BSA) 1g을 10x PBS 원액 5mL에 용해시킵니다. 1.5% 세제 원액 10mL를 추가합니다. 모든 성분이 적절하게 용해될 때까지 용액을 저어주고 최종 부피 50mL에 도달할 때까지 증류된H2O를 첨가합니다. 용액을 분취하고 분취액을 동결하여 보관합니다.
- 2차 형광단 결합 항체(1차 Syt1 항체 종에 대한 대상)를 각 웰의 200μL 차단 완충액에 1:1000 희석으로 희석합니다.
- 커버슬립이 들어 있는 각 웰에서 1x PBS를 제거하고 폐기합니다.
- 각 웰에 200μL의 차단 완충액-항체 혼합물을 추가하고 RT에서 60분 동안 배양합니다.
주의: 2차 항체는 빛에 민감하기 때문에 앞으로 나아가는 모든 단계는 어둠 속에서 수행해야 합니다.
- 배양 후 1x PBS 1mL로 5분 동안 세포를 3회 세척합니다.
- 임베딩 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 커버슬립을 삽입합니다.
- 7μL의 포매 배지를 현미경 슬라이드에 떨어뜨립니다. 주사기로 들어 올리고 집게로 잡아 24웰 플레이트에서 커버슬립을 제거합니다.
주의: 커버슬립 표면의 세포는 쉽게 손상되므로 집게는 주의해서 다루어야 합니다.
- 커버슬립을 증류수에 담궈 PBS를 제거하고 한쪽 가장자리를 연조직에 대고 조심스럽게 건조시킵니다.
- 커버슬립을 포매 배지 액적 위로 뒤집어 세포를 운반하는 표면이 현미경 슬라이드를 향하도록 하여 세포를 포매 배지에 임
베딩합니다.
- 슬라이드를 후드 아래에서 1 - 2시간 동안 건조시킨 후(빛 노출을 피하기 위해 덮음) 4°C의 현미경 슬라이드 상자에 보관합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.