Alpha-Synuclein 응집체로 처리된 뉴런의 면역염색

초록

출처: Panattoni, G., et al. 원섬유 형성의 강력한 세포 모델로서 1차 뉴런에 마이크로솜 관련 알파-시누클레인 응집체의 외인성 투여. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 알파-시누클레인(αS) 응집체로 처리된 뉴런의 면역 염색을 보여줍니다. 뉴런은 먼저 αS 응집체로 처리됩니다. 그런 다음 고정, 투과화 및 차단 용액으로 처리됩니다. 1차 항체가 추가되고, 그 다음에 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색이 추가됩니다. 그런 다음 샘플을 장착하고 현미경으로 관찰합니다.

프로토콜

1. 뉴런 치료

참고: 처리는 Division (DIV) 7에서 수행되었습니다. 모든 단계는 멸균 상태에서 세포 배양 후드 아래에서 수행됩니다. DIV 7에서 피질 신경 세포 배양 밀도의 예가 그림 1에 예시되어 있습니다.

1. 3개의 서로 다른 병에 걸린 형질전환 마우스의 척수에서 얻은 풀 마이크로솜 관련 αS 응집체를 사용하여 1μg/μL 용액을 갖고, 원래의 균질화 완충액[250mM 자당, 20mM HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산], 10mM KCl(염화칼륨), 1.5mM MgCl₂(염화마그네슘), 2mM EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산), 및 1x phosphatase/protease-inhibitors]를 사용하여 희석할 수 있습니다.
2. 배지(2% B27, 10x 겐타마이신 및 2mM 글루타민)를 포함하는 24개의 웰 플레이트에서 poly-D-Lysine 커버슬립에 대한 뉴런 배양을 수행합니다. 배지의 1/3을 제거하고 2% B27, 1x 겐타마이신 및 2mM 글루타민을 함유한 새 배지로 부드럽게 교체합니다.
3. 1μg의 풀링된 마이크로솜 관련 알파-시누클레인(αS) 응집체를 세포 배지에 추가합니다. 뉴런을 37°C의 인큐베이터로 되돌립니다.
4. 1주일 동안 3일마다 신선한 배지의 1/3을 첨가하십시오. 매체를 교체하지 마십시오. 그냥 추가하십시오.
5. 치료 1주일 후 배지의 1/3을 제거하고 2% B27, 10μg/mL 겐타마이신 및 2mM 글루타민을 함유한 새 배지로 부드럽게 교체합니다. 3일마다 반복하십시오.
6. 치료 2주 후 뉴런을 수정합니다(DIV 21).

2. 면역형광

1. PBS(Phosphate-Buffered Saline) 1x에 2% 파라포름알데히드와 5% 자당 용액으로 화학 흄 후드 아래에서 흔들리지 않고 실온(RT)에서 15분 동안 뉴런을 고정합니다.
2. 고정 용액을 제거합니다. PBS 1x로 3회 짧게 세탁합니다.
   메모: 일차 뉴런이 폴리-라이신 커버슬립에 단단히 달라붙지 않기 때문에 모든 세척 단계를 부드럽게 수행하십시오.
3. RT에서 5분 동안 PBS 1x의 0.3%의 비이온 계면활성제로 뉴런을 투과시킵니다.
4. PBS 1x로 3회 짧게 세탁합니다.
5. PBS 1x에 3% 소태아혈청(FBS)이 함유된 뉴런을 RT에서 30분 동안 배양하여 안와 쉐이커의 불특이적 결합 부위를 차단합니다.
6. 오비탈 쉐이커에서 PBS 1x의 3% FBS, O/N에서 4°C에 적절한 1차 항체가 용해된 적절한 1차 항체로 뉴런을 배양합니다.
   참고: syn303 (1:1,000), mouse αS (1:200), pser129-αS (1:1,000) 및 Tau (1:10,000) 항체가 사용되었습니다.
7. 항체 용액을 제거하고 PBS 1x로 3회 짧게 세척합니다.
8. PBS의 3% FBS에 용해된 적절한 형광 2차 항체가 있는 뉴런을 안와 쉐이커의 어둠 속에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
9. 항체 용액을 제거하고 PBS 1x로 3회 짧게 세척합니다.
10. DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) 용액(PBS 1x에서 0.1μg/mL)으로 안와 쉐이커의 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 뉴런을 염색합니다.
11. 항체 용액을 제거하고 PBS 1x로 3회 짧게 세척합니다.
12. 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다.

결과

그림 1. 피질 신경 배양. 피질 신경 세포 배양의 DIV 7에서 밀도를 보여주는 대표 이미지. 이미지는 도립광 현미경인 10X 대물렌즈로 촬영했습니다. 눈금 막대 = 100μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자당	시그마-알드리치	84097-1킬로그램
헤페스	시그마-알드리치	H0887-100ML	1M 산도 = 7-7.6
에디타	시그마-알드리치	0390-100ml	pH=8 0.5M
염화마그네슘	시그마-알드리치	M8266-100G
소다	시그마-알드리치	S7795-500지
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S5761-500지
메탄올	시그마-알드리치	322415-6X1L
케이클	시그마-알드리치	P9541-500G
컴플레트 미니	로슈	11836170001	프로테아제 억제제
포스스톱	로슈	4906837001	인산가수분해효소 억제제
BCA 단백질 분석 키트	유로클론	EMPO14500
Criterion TGX 4-20% 무스테인, 18웰	비오라드	5678094
지원되는 니트로셀룰로오스 멤브레인	비오라드	1620097	0.2 μm의
블로팅 등급 차단제	비오라드	1706404	무지방 분유
SuperSignal West Pico 화학발광 기판	Termo Fisher 사이언티픽	34077
질산	시그마-알드리치	1004411000	65%
유리 커버 슬립	Termo Fisher 사이언티픽	1014355118NR1	18mm x
폴리-D-라이신	시그마-알드리치	P7280
Hank's Balanced Salt 솔루션	Termo Fisher 사이언티픽	14170-500 밀리리터
페니실린/스트렙토마이신	Termo Fisher 사이언티픽	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
둘베코의 변형된 독수리의 매체	Termo Fisher 사이언티픽	D5796-500 밀리리터
트립신-EDTA	Termo Fisher 사이언티픽	15400054	0.50%
B27 보충제	Termo Fisher 사이언티픽	17504044	50배
글루타맥스	Termo Fisher 사이언티픽	제35050-038	100배
DNA제	시그마-알드리치	D5025
소 태아 세럼	유로클론	EC50182L
조미료	시그마-알드리치	1446600-1지
겐타마이신	Termo Fisher 사이언티픽	15710	10 밀리그램 / 밀리람베르트
Neurobasal 배지	Termo Fisher 사이언티픽	제10888-022
시토신 아라비노시드(AraC)	시그마-알드리치	C3350000
VECTASHIELD 페이드 방지 마운팅 매체	벡터 연구소	H-1000
다피	Termo Fisher 사이언티픽	62247
90 Ti 로터	베크만	해당 사항 없음	초원심분리기 로터
Optima L-90K 초원심분리기	베크만	해당 사항 없음
Syn-1 항체, 클론 42	BD 바이오사이언스	610786	안티 마우스 WB: 1:5000
Syn303 항체	바이오레전드	824301	안티 마우스 IF: 1:1000
Tau 항체	시냅스 시스템	314 002	안티 토끼 IF: 1:10,000
pser129-αS 항체	후지와라 외의 선물, 참고 19		안티 토끼 WB : 1:5000
pser129-αS 항체	아브캠	AB51253	안티 토끼 IF: 1:1000
마우스 αS(D37A6) XP	세포 신호 전달	4179	안티 토끼 IF 1:200
Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit 항체	Termo Fisher 사이언티픽	A27039
Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse 항체	Termo Fisher 사이언티픽	A-11029
마이크로슨 XL-2000	미소닉스		초음파 처리기
울트라 보틀 (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, 어셈블리, Noryl Cap, Beckman 타입	유럽 과학 서비스	S4484	초원심분리기 튜브
AXIO Observer 도립광 현미경	자이스	해당 사항 없음
TCS SP2 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	라이카	해당 사항 없음
도립 에피 형광 현미경	니콘	해당 사항 없음
트리톤 x-100	시그마-알드리치	엑스100-500ML	비이온성 계면활성제

(영문) 호 년 호 시리즈 년