An In Vitro Model of Stretch Injury in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons

초록

출처: Phillips, J. K. et al. 96웰 형식의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런의 고속 스트레치 손상 방법. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런(hiPSCN)에 스트레치 손상을 유도하는 과정을 보여줍니다. 세포는 실리콘 멤브레인이 부착된 바닥이 없는 다중 웰 플레이트에서 채취됩니다. 제어된 기계적 응력이 세포막에 가해져 세포골격 파괴 및 세포막 손상을 유도하여 세포에 스트레치 손상 표현형을

유도합니다.

프로토콜

1. 플레이트 제작

1. 96웰 플레이트 상판을 200W 플라즈마 클리너(재료 표 참조)로 60초 동안 고출력으로 플라즈마 처리한 후 플라즈마 클리너 내부에 바닥이 위로 향하도록 놓습니다. 챔버의 창을 통해 보이는 보라색 빛을 확인하면 효과적인 플라즈마가 형성되었음을 나타냅니다. 이 결합 기술은 Sunkara et al.에서 채택되었습니다.
2. 60초 이내에 탈이온수(DI) 중 1.5%(3-아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES) 200mL에 플레이트 상단을 바닥이 아래로 향하게 하여 20분 동안 놓습니다. 이 솔루션은 불안정합니다: 플레이트를 도입하기 전에 60초 이상 준비하지 마십시오.
   주의: 흄 후드에서 APTES와 함께 작업하십시오.
3. 플라즈마는 추출된 실리콘 멤브레인을 플라즈마 클리너에서 고출력으로 60초 동안 처리합니다. 1.2단계에서 20분 기간이 끝나기 5분 전에 혈장 처리가 완료되도록 시간을 측정합니다.
4. 집게를 사용하여 플라즈마 처리된 멤브레인을 7.5 x 11cm² 양피지 직사각형 위에 배치합니다. 플레이트 제작 cl의 하단 부분에 7.5cm x 11cm x 0.5cm 알루미늄 슬래브를 정렬합니다.amp. 집게를 사용하여 알루미늄 슬래브에 실리콘 멤브레인과 양피지를 정렬합니다.
5. APTES 수조에서 플레이트 상단을 제거하고 여분의 용액을 털어냅니다. 200mL DI 수조에 5초 동안 담그고 여분의 물을 털어냅니다. 다른 200mL DI 수조에 5초 동안 담그고 여분의 물을 털어냅니다. 다른 접시 상단을 담그기 전에 이 수조의 물을 교체하십시오.
6. 압축 공기를 사용하여 플레이트 상단을 완전히 건조시킵니다.
7. 플레이트 제작 cl의 상단 부분에 플레이트 상단을 놓습니다.amp. 플레이트 제작 cl을 부드럽게 닫습니다.amp 플레이트 상단과 실리콘을 함께 누릅니다. 최소 1시간 동안 클램프를 사용합니다.
8. 사용하기 전에 접시를 실온에서 24시간 동안 경화시키고 먼지로부터 보호하십시오.

2. 플레이트 늘리기

1. 인덴터 청소
   1. 실온에서 DI 워터로 60W 수조 스타일 초음파 처리기를 준비합니다.
   2. 초음파 처리기 수조 위의 인덴터 블록을 지지하고 인덴터의 상단만 최소 1mm 깊이까지 잠기도록 거꾸로 합니다. 42kHz에서 8분 동안 인덴터를 초음파 처리합니다.
   3. 압축 공기로 인덴터를 드라이합니다.
2. 인덴터 블록 정렬
   1. 스트레치 장치 위에 라이브 피드가 있는 카메라를 배치하여 인덴터 어레이를 내려다보도록 합니다. 들여쓰기의 위쪽에 초점을 맞춥니다.
      메모: 섹션 3, "멤브레인 스트레치 특성화"에 설명된 설정은 이 작업을 위한 가능한 카메라 설정 중 하나입니다.
   2. s에 플레이트를 고정합니다.tag스테이지 클램프(그림 1)를 사용하여 부상 장치의 e.
      메모: 기기 제어 소프트웨어에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
   3. 부상 장치를 제어하는 컴퓨터의 바탕 화면에 있는 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 기기 제어 소프트웨어를 실행합니다. 실행 창에서 "in_vitro_neurotrauma.lvproj" 프로젝트를 클릭하여 실행합니다. 프로젝트 창에서 각각 'motion_control.vi' 및 'position_tracker.vi'라는 이름의 모션 컨트롤 및 위치 추적기 가상 계측기 (VI)를 더블 클릭하여 시작합니다.
   4. 부상 장치를 둘러싼 케이지를 닫습니다. 모션 컨트롤 VI의 왼쪽 상단 모서리에 있는 '화살표' 버튼을 눌러 VI를 실행하고 'Near Bottom'을 클릭하여 인덴터에 접촉한 후 2mm 이내로 스테이지를 내립니다. 'Stop' 버튼을 클릭하여 VI.
      주의: 케이지에서 카메라를 조작할 때 들것에 손을 대지 마십시오. 케이지에는 케이지 도어가 닫혀 있을 때만 스트레치 장치에 전원을 공급하는 도어 스위치가 장착되어 있어야 합니다.
   5. 프로젝트 창에서 'Axis 1'을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 'Interactive Test Panel'을 클릭합니다. 열리는 창에서 'Target Position' 필드에 '500' 단위를 입력하여 단계 크기를 50μm로 설정합니다.
   6. 'Interactive Test Panel' 창 하단에 있는 녹색 '이동' 버튼을 플레이트가 인덴터와 처음 접촉할 때까지 반복해서 클릭합니다. 카메라에 표시되는 라이브 이미지에서 연락처를 확인합니다. 'Interactive Test Panel' 창의 왼쪽 상단에 보고된 수직 스테이지 위치를 확인합니다. 이것이 첫 번째 접촉 위치입니다.
   7. 모든 웰이 인덴터와 접촉할 때까지 (2.2.6단계에서 설명한 대로) 더 내립니다. 필요한 경우 카메라를 움직여 전체 플레이트를 보고 스테이지를 위로(음수 'Target Position' 지정) 및 아래로 이동합니다. 모든 게시물이 접촉할 때 창의 왼쪽 상단에 보고된 수직 스테이지 위치(전체 접촉 위치)에 유의하십시오.
   8. 첫 번째 접점 위치와 완전 접점 위치의 차이점을 확인합니다. 'Interactive Test Panel'을 닫습니다. '모션 컨트롤 VI'(2.2.4 단계 참조)를 실행하고 '상단'을 클릭하여 스테이지를 올립니다. 'Stop' 버튼으로 모션 컨트롤 VI를 중지합니다.
   9. 스테이지가 이동의 맨 위에 있으면 문을 열어 장치를 비활성화합니다. 인덴터 블록의 모서리에 있는 고정 나사를 조정합니다. 먼저 접촉한 모서리의 고정 나사를 풀어 낮추고 반대쪽 나사를 조여 마지막으로 접촉한 모서리를 올립니다.
   10. 플레이트가 인덴터에 닿을 때까지 스테이지를 낮추고, 접촉 이미지에 기울기가 있는지 검사하고, 스테이지를 올리고, 인덴터 블록을 조정(2.2.9단계)하는 과정을 반복합니다. 스테이지와 블록이 정렬되면 모든 인덴터가 한 번에 접촉합니다.
   11. 문을 열어 장치를 비활성화합니다. 타이다운 나사를 인덴터 블록의 구멍에 삽입하고 조입니다. 블록이 고정 나사가 제자리에 있는 상태에서 수평인지 확인합니다(단계 2.2.4-2.2.8). 플레이트가 접촉할 때 'Interactive Test Panel'에서 보고하는 스테이지 위치를 기록해 두십시오. 이것은 압입 실험을 위한 0 위치가 됩니다.
3. 인덴터에 윤활유를 바르십시오.
   1. 인덴터 블록이 방금 설정되었고 아직 윤활되지 않은 경우 에탄올을 적신 실험실 물티슈로 단단한 고무 패드(7.5cm x 11cm x 1.5mm)와 부드러운 폐쇄 셀 발포 고무 패드(7.5cm x 11cm x 3mm)를 청소합니다. 자연 건조시키십시오.
   2. 실험실 물티슈를 옥수수 기름에 적셔 단단한 고무 패드에 펴 바르면 둔한 광택이 납니다.
   3. 폼 패드를 단단한 고무 패드 위에 올려 놓아 오일을 폼 패드로 옮깁니다. 폼 패드 위에 7.5cm x 11cm x 0.5cm 알루미늄 슬래브를 놓고 약 360g의 밸러스트 중량(예: 각각 45mL의 물이 적재된 6개의 원추형 튜브)을 로드하여 단단한 고무 패드에서 폼 패드로 오일이 일관되게 전달되도록 합니다. 오일이 발포 고무 패드로 옮겨질 때까지 10초 동안 기다립니다.
   4. 발포 고무 패드를 인덴터 어레이로 이동합니다. 알루미늄 슬래브와 밸러스트 추를 그 위에 올려 오일이 인덴터 팁으로 일관되게 전달되도록 합니다. 오일이 인덴터로 옮겨질 때까지 10초 동안 기다립니다.
   5. 인덴터 블록을 설정하고 처음으로 윤활한 이후 플레이트를 늘리지 않은 경우 실험을 시작하기 전에 테스트 플레이트를 늘립니다. 참고: 이렇게 하면 첫 번째 스트레치와 후속 스트레치 사이의 불일치로 인해 실험이 혼란스러워지는 것을 방지할 수 있습니다. 후속 스트레칭의 경우 각 스트레치 전에 2.3.2-2.3.5 단계만 반복합니다.
4. 접시를 늘리십시오
   1. 2.3단계에서 설명한 대로 인덴터에 윤활유를 바르십시오.
   s
   2. 에 플레이트를 고정하십시오.tags와 함께 부상 장치의 stag에스tag에스. 멸균이 필요한 경우 뚜껑의 위치를 조정하여 배양 표면이 실내 공기에 노출되지 않도록 플레이트를 고정합니다.
   3. '모션 컨트롤 VI'를 사용하여 스테이지를 제로 위치로 내립니다 (2.2.4-2.2.6 단계 참조). 제로 위치는 2.2 단계에서 결정됩니다.
   4. '위치 추적 VI'의 "파일 경로" 필드에 있는 파일 이름을 고유한 파일 이름으로 변경한 다음 해당 창의 왼쪽 상단 모서리에 있는 '화살표' 버튼으로 실행합니다.
   5. 'movement control panel VI'의 'Injury (mm)' 및 'Injury Duration (ms)' 필드에서 필드를 클릭하고 원하는 값을 입력하여 들여쓰기의 깊이와 지속 시간(일반적으로 각각 1-4mm 및 30ms, 최대 깊이 5mm, 최소 지속 시간 15ms)을 설정합니다.
   6. '무브먼트 컨트롤 패널 VI'를 실행하고 'Injure'를 클릭하여 플레이트를 들여씁니다.
   7. 'Top'을 클릭하여 스테이지를 이동 거리의 맨 위로 이동합니다. 그런 다음 'Stop' 버튼으로 VI를 중지하고 도어를 열어 부상 디바이스를 비활성화합니다.
   8. 'Position Tracker VI'에 표시된 스테이지의 변위 이력을 검사하여 지정된 최대 변위가 적용되었는지 확인합니다. 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'Excel로 내보내기'를 클릭합니다. '파일| 저장'을 클릭하여 데이터를 저장합니다.

3. 멤브레인 스트레치 특성화

1. 각 인덴터 상단의 오목한 부분을 흰색으로 칠하여 고속 비디오 촬영을 위한 고대비 배경을 제공합니다. 주의: 판과 접촉하는 인덴터의 테두리를 칠하지 마십시오.
2. 폴리(젖산)(PLA)로 3D 프린팅하거나 각 웰에 점을 만드는 데 사용할 원통형 스탬프를 제작합니다. 실린더를 직경 5.9mm, 높이 12.2mm로 만들고 원통형 돌출부는 직경 1.5mm, 높이 1.0mm로 상단 중앙에 놓습니다.
3. 플라즈마는 2.1단계에서 언급한 것처럼 플레이트를 우측이 위로 처리하여 60초 동안 웰의 실리콘 세포 배양 표면을 활성화합니다.
4. 고무 패드나 다른 부드러운 표면에 플레이트를 놓습니다. 스탬프의 작은 돌출부(1.2단계 참조)를 영구 마커 펜의 잉크로 프라임합니다. 삽입할 스탬프를 테스트할 웰에 삽입하고 탭하여 잉크가 잘 전달되도록 합니다. 모든 우물 앞에 우표를 프라임하십시오.
5. 인덴터 블록을 정렬하고 부상 장치의 인덴터에 윤활유를 바릅니다(2.2-2.3단계 참조). Clamp 부상 장치의 무대에 플레이트. 부상 장치 위에 밝은 확산 축 조명을 배치합니다.
6. 부상 장치 위의 붐 스탠드에 고속 카메라를 설치하고 렌즈를 가장 작은 f-스톱으로 설정하고 전원을 켭니다. 카메라에 연결된 컴퓨터에서 카메라 소프트웨어를 실행합니다. 프레임 속도 드롭다운 메뉴에서 초당 2,000프레임을 선택하고 셔터 드롭다운 메뉴에서 고대비 이미지를 생성하는 가장 빠른 노출 시간을 선택합니다. 점선으로 된 우물 중앙.
   1. 시야각에 3 x 4 그리드에 12개의 웰이 포함되도록 카메라를 배치합니다.
      메모: 이 시야는 1,280 × 1,024 이미지에 대한 처리량과 해상도 간의 최적 절충안을 제공합니다.
7. 플레이트를 영점으로 내립니다(2.2.4-2.2.6 단계 참조). 카메라 소프트웨어의 녹화 버튼을 한 번 클릭하여 'trigger in'이라고 표시합니다. 위치 추적기 VI를 시작합니다(단계 2.4.4).
8. 밝은 확산 축 라이트를 켭니다. 2.4.6단계에서 설명한 대로 플레이트를 들여씁니다.
9. 밝은 확산 축 조명을 끕니다.
10. 카메라 제어 컴퓨터에서 들여쓰기가 발생하는 녹화의 30-40ms 창을 찾습니다: 카메라 소프트웨어의 고속 비디오 재생 표시줄에서 시작 및 끝 화살표를 드래그합니다. 저장을 클릭하고 '파일 이름' 필드에 이름을 설정하고 '형식' 필드에서 'TIFF'를 선택한 다음 '저장'을 클릭합니다.
    1. 를 통해 보세요. 가장 적게 늘어난 상태(시작) 상태와 가장 많이 늘어난 상태(최대 들여쓰기) 상태의 이미지를 위한 TIF 파일.
    2. 두 이미지에 있는 점의 높이와 너비를 측정하려면 피지를 사용하여 가장 적게 늘어난 이미지와 가장 많이 늘어난 이미지를 나란히 엽니다. 기본 사각형 선택 도구를 사용하여 클릭하고 드래그하여 가장 스트레치가 적은 이미지의 점 주위에 상자를 그립니다. 'Analyze| 측정'.
    3. 피크 스트레치 이미지에서 동일한 웰에 있는 점에 대해 반복합니다. 나머지 우물에 대해 반복합니다.
11. x 방향과 y 방향의 라그랑주 변형률을 다음과 같이 계산합니다.
    
    메모: 여기서, E_xx는 x 방향의 라그랑주 변형률, E_yy는 y 방향의 라그랑주 변형률, X는 점의 너비, Y는 점의 높이, _f는 최종 이미지(즉, 피크 인덴테이션 이미지)를 나타냄, _i는 초기 이미지(즉, 사전 인덴테이션 이미지)를 나타냅니다. 두 값의 평균을 구하여 해당 우물의 변형을 결정합니다.

4. 배양된 세포 도금

1. 멸균에 사용될 용기와 밸러스트 추를 오토클레이브합니다.
2. 플라즈마는 실리콘 바닥판을 60초 동안 오른쪽이 위로 향하게 처리합니다(1.1단계 참조). 즉시 플레이트를 70% 에탄올이 들어 있는 멸균 통에 15분 동안 담그십시오.
3. 플레이트를 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 별도의 멸균 용기에 30분 동안 담급니다.
4. 우물에서 PBS를 흡입합니다. 우물이 플라즈마 처리를 잃는 것을 방지하기 위해 한 번에 한 접시만 말리십시오.
   주의: 실리콘 바닥 플레이트는 파이펫팅 시 단단한 플레이트보다 촉각 피드백이 적으며 파이펫 팁을 막을 가능성이 더 높습니다.
5. 웰당 100μL의 0.1mg/mL 폴리-L-오르니틴(PLO)을 멸균된 플레이트에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
6. 100μL 멸균 PBS로 웰을 두 번 헹구고 세포 현탁액이 준비될 때까지 웰에서 두 번째 세척을 둡니다.
7. 안전 장갑을 사용하여 액체 질소 저장소에서 hiPSCN 바이알을 제거하고 드라이아이스 위에 놓습니다. 바이알을 37°C 수조로 빠르게 운반하고 정확히 3분 동안 해동합니다. 바이알을 휘젓지 마십시오.
8. 멸균 후드에서 1mL 혈청학 피펫을 사용하여 바이알의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
9. 빈 극저온 바이알을 1mL의 실온 완전 유지보수 매체(배지 베이스 + 보충제)로 헹굽니다.
10. 1mL의 배지를 초당 약 1방울씩 50mL 튜브에 적가합니다. 추가하면서 튜브를 부드럽게 휘젓습니다. 8mL의 실온 완전 유지보수 배지를 50mL 튜브에 약 2방울/초의 속도로 추가합니다.
11. 튜브를 덮고 2-3회 뒤집습니다. 혈구계로 세포를 세십시오. 세포 현탁액을 225,000 cells/mL로 희석하는 데 필요한 추가 배지의 부피를 계산합니다.
12. 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액의 튜브에 배지의 양(위에서 계산)을 부드럽게 피펫으로 넣습니다.
13. 1,000μL 마이크로피펫을 사용하여 세포 현탁액 1mL당 10μL의 1mg/mL 라미닌 스톡을 추가하여 세포 현탁액에서 10μg/mL의 라미닌을 달성합니다. 라미닌에 사용되는 팁으로 위아래로 한 번 흡입한 다음 튜브를 덮고 튜브를 한 번 뒤집습니다.
14. 한 번에 하나의 플레이트에서 PBS를 흡입합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 hiPSCN 세포 현탁액을 추가합니다. 웰의 배양 면적은 0.33cm2이므로 면적당 세포 밀도는 67,500 cells/^cm2입니다.
15. 부착을 촉진하기 위해 파종 후 15분 동안 접시를 실온에서 쉬게 합니다. 멸균 배양 후드의 팬 진동을 방지하려면 덮인 플레이트를 실험실 벤치에 놓으십시오. 37 ° C에서 5 % CO₂로 배양하십시오.
16. 24시간 후에 전체 매체 교체를 수행하여 웰에 200μL의 완전한 유지보수 매체를 다시 채웁니다. 2-3일마다 100μL/웰의 절반 배지 교체를 수행합니다.

5. 문화의 손상

1. 인덴터 블록을 정렬하고 2.2단계에 설명된 대로 0 위치를 찾습니다. 2.3단계에서 설명한 대로 인덴터에 윤활유를 바르십시오.
2. '위치 추적기 VI'에서 변위 이력의 파일 이름을 설정합니다(단계 2.4.4). '모션 컨트롤 VI'에서 부상 파라미터를 설정합니다(단계 2.4.5).
3. 인큐베이터에서 다칠 접시를 꺼내 무대에 고정합니다. 배양물을 실내 공기에 노출시키지 않고 플레이트를 고정하도록 뚜껑의 위치를 조정합니다.
4. '모션 컨트롤 VI'를 사용하여 플레이트를 영점으로 내립니다(단계 2.2.4-2.2.6). '위치 추적기 VI'를 시작합니다(단계 2.4.4).
5. 이동 컨트롤 VI를 사용하여 플레이트를 들여씁니다(2.4.6단계에서 설명). 가짜 스트레치의 경우 이 단계만 건너뜁니다.
6. 스테이지를 동작 범위의 맨 위로 되돌립니다(2.4.7단계 참조). 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
7. 변위 추적을 검사하고 저장합니다(2.4.8단계 참조).

결과

그림 1: 부상 장치의 레이블이 지정된 회로도.(A) 평면도, (B) 등각투영 뷰, (C) 정면도, (D) 오른쪽 뷰. 축척 막대는 직교 뷰(A, B 및 D)에 적용됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
.010" 실리콘 시트	전문 제조, Inc	#70P001200010	폴리디메틸실록산(PDMS) 시트
스파클린	피셔 사이언티픽	#043204
Nunc 256665	피셔 사이언티픽	#12-565-600	바닥이 없는 96웰 플레이트
킴 물티슈	ULINE	S-8115
플라즈마 클리너	해릭 플라즈마	#PDC-001-HC
(3-아미노프로필) 트리에톡시실란	시그마-알드리치	#440140	압테
양피지	레이놀즈	해당 사항 없음
돔 라이트	주식회사 CCS	LFX2-100SW
돔 라이트 전원 공급 장치	주식회사 CCS	PSB-1024VB
축방향 확산 조명 장치	지멘스	네르라이트 DOAL-75-LED	확산 축 광
고전력 LED 어레이	크리 어	XLamp CXA2540	고전력 LED 어레이
LED 홀더	몰렉스	1807200001	LED 홀더
LED 전원 공급 장치	뜻이 좋아	HLG-320H-36B	정전류 전원 공급 장치
FastCam Viewer 소프트웨어	포트론		카메라 softeware
패스트캠 미니 UX50	포트론	해당 사항 없음	고속 카메라
마이크로 NIKKOR 105mm f/2.8	니콘	#의 1455	고속 카메라 렌즈
0.1 mg/mL 폴리-L-오르니틴	시그마-알드리치	#P4597
아이셀	셀룰러 다이나믹스 인터내셔널	#NRC-100-010-001
iCell 매체	셀룰러 다이나믹스 인터내셔널	#NRM-100-121-001
iCell 보충제	셀룰러 다이나믹스 인터내셔널	#NRM-100-031-001
라미닌	시그마-알드리치	#L2020
보이스 코일 액츄에이터	BEI 킴코	LA43-67-000A
광학 리니어 엔코더	레니쇼	T1031-30ᅡ
서보 드라이브	코플리 컨트롤즈	제누스 XTL
컨트롤러	내쇼날인스트루먼트	cRIO 9024 실시간 PowerPC 컨트롤러
cRIO 섀시	내쇼날인스트루먼트	크리오 9113
디지털 입력 모듈	내쇼날인스트루먼트	NI 9411
데이터 수집 섀시	내쇼날인스트루먼트	NI 9113
LabVIEW (볼록뷰	내쇼날인스트루먼트
히PSCNs	셀룰러 다이나믹스 인터내셔널

스 시리즈