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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 동물
- TgBAC(gfap:gfap-GFP) 제브라피쉬 167(AB) 균주를 26.5°C의 온도와 14/10시간의 라이트/다크 사이클의 물에서 표준 조건에서 6-9개월 동안 유지합니다.
2. 가역적 전신 마취
- 400mg의 트리카인 분말을 97.9mL의 탱크 물과 2.1mL의 Tris 완충 식염수(TBS) 1mL에 용해시켜 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)의 원액을 준비합니다. 1M Tris(pH 9)로 pH 7.0으로 조정하고 4°C에서 암흑 속에서 최대 한 달 동안 보관합니다.
메모: 트리카인은 동물의 자연 생활 조건과 같은 물에서 준비해야 하며, 바람직하게는 원래의 탱크 물을 사용해야 합니다.
- 원액을 탱크 물에 1:25로 희석하고 즉시 사용하십시오.
- 제브라피쉬가 움직일 수 없게 되고 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 마취액 50mL가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 제브라피시를 넣습니다(체중 및 연령에 따라 약 2 - 5분).
- 레이저 치료를 위해 각 물고기를 맞춤형 실리콘 핀 홀더에 손으로 옮깁니다(그림 1A).
주의! 물고기는 최대 10분 동안만 탱크 밖에서 마취 상태를 유지할 수 있습니다.
- 치료 및/또는 이미징 후 마취를 역전시키려면 제브라피시를 탱크 물이 담긴 용기에 넣으십시오.
- 회복을 지원하려면 제브라피시를 물 속에서 앞뒤로 움직여 아가미 위로 신선한 탱크 물의 흐름을 만듭니다.
3. 망막의 레이저 국소 손상
참고: 532nm 다이오드 레이저는 제브라피쉬의 망막에 초점광 손상을 일으키는 데 사용됩니다. 레이저의 실험적 설정을 통해 성체 제브라피시에서 재현 가능한 국소 망막 손상을 확립할 수 있습니다.
- 레이저의 출력 전력 설정: 70mW, 공중 직경: 50μm, 펄스 지속 시간: 100ms.
주의! 레이저 광을 사용하려면 적절한 개인 보호 및 해당 부위에 대한 라벨링이 필요합니다.
- 치료 전에 2% 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 1 - 2방울을 눈에 국소적으로 바르고 2.0mm 안저 레이저 렌즈를 사용하여 레이저 조준 빔을 망막에 초점을 맞춥니다.
주의! 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 방울은 점성이 있어 아가미에 묻으면 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다.
- 왼쪽 눈의 시신경 주위에 4개의 레이저 스팟을 배치하고 치료되지 않은 오른쪽 눈을 내부 제어로 사용합니다.
