Targeting Retinal Degeneration and Regeneration in Zebrafish Using a Focal Laser Injury(초점 레이저 손상을 사용한 제브라피시의 망막 퇴행 및 재생 모델링)

초록

출처: Conedera, F. M., et al. 제브라피시의 레이저 유도 망막 변성 및 재생 모델에서 Müller Glia 세포 활성화. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 레이저 손상을 사용하여 성인 제브라피시의 망막 변성을 유도하는 절차를 보여줍니다. 레이저는 망막의 광수용체 세포를 표적으로 삼아 세포 사멸과 퇴행성 과정을 유발합니다. 이 손상은 뮐러 신경교세포(MG) 세포를 활성화하여 망막 재생을 돕는 줄기세포 전구세포로 역분화시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. TgBAC(gfap:gfap-GFP) 제브라피쉬 167(AB) 균주를 26.5°C의 온도와 14/10시간의 라이트/다크 사이클의 물에서 표준 조건에서 6-9개월 동안 유지합니다.

2. 가역적 전신 마취

1. 400mg의 트리카인 분말을 97.9mL의 탱크 물과 2.1mL의 Tris 완충 식염수(TBS) 1mL에 용해시켜 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염(트리카인)의 원액을 준비합니다. 1M Tris(pH 9)로 pH 7.0으로 조정하고 4°C에서 암흑 속에서 최대 한 달 동안 보관합니다.
   메모: 트리카인은 동물의 자연 생활 조건과 같은 물에서 준비해야 하며, 바람직하게는 원래의 탱크 물을 사용해야 합니다.
2. 원액을 탱크 물에 1:25로 희석하고 즉시 사용하십시오.
3. 제브라피쉬가 움직일 수 없게 되고 외부 자극에 반응하지 않을 때까지 마취액 50mL가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 제브라피시를 넣습니다(체중 및 연령에 따라 약 2 - 5분).
4. 레이저 치료를 위해 각 물고기를 맞춤형 실리콘 핀 홀더에 손으로 옮깁니다(그림 1A).
   주의! 물고기는 최대 10분 동안만 탱크 밖에서 마취 상태를 유지할 수 있습니다.
5. 치료 및/또는 이미징 후 마취를 역전시키려면 제브라피시를 탱크 물이 담긴 용기에 넣으십시오.
6. 회복을 지원하려면 제브라피시를 물 속에서 앞뒤로 움직여 아가미 위로 신선한 탱크 물의 흐름을 만듭니다.

3. 망막의 레이저 국소 손상

참고: 532nm 다이오드 레이저는 제브라피쉬의 망막에 초점광 손상을 일으키는 데 사용됩니다. 레이저의 실험적 설정을 통해 성체 제브라피시에서 재현 가능한 국소 망막 손상을 확립할 수 있습니다.

1. 레이저의 출력 전력 설정: 70mW, 공중 직경: 50μm, 펄스 지속 시간: 100ms.
   주의! 레이저 광을 사용하려면 적절한 개인 보호 및 해당 부위에 대한 라벨링이 필요합니다.
2. 치료 전에 2% 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 1 - 2방울을 눈에 국소적으로 바르고 2.0mm 안저 레이저 렌즈를 사용하여 레이저 조준 빔을 망막에 초점을 맞춥니다.
   주의! 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 방울은 점성이 있어 아가미에 묻으면 호흡에 문제를 일으킬 수 있습니다.
3. 왼쪽 눈의 시신경 주위에 4개의 레이저 스팟을 배치하고 치료되지 않은 오른쪽 눈을 내부 제어로 사용합니다.

결과

그림 1: 제브라피시 망막의 레이저 손상 유도 설정 및 OCT 분석 후. (A) 치료 전 레이저 시스템의 배치. (A.1) 레이저 빔을 적용하기 직전에 안저 콘택트 렌즈가 장착된 실리콘 핀 홀더에 제브라피쉬를 올려 놓습니다. (B) 이미징 전 OCT 시스템의 배치. (B.1) OCT를 통해 손상 부위를 감지하기 전에 78D 슬릿 램프 렌즈 앞에 놓인 얼룩말.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
하이드록시프로필메틸셀룰로오스 2%	옴니비전(OmniVision), 스위스 노이하우젠	북미	메토셀 2%
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이	Sigma-Aldrich, Buchs, 스위스	A5040	트리카인, MS-222
비술라스 532s	Carl Zeiss Meditec AG, 독일 오버코헨	북미	532nm 레이저
실리콘 핀 홀더	Huco Vision AG 스위스	북미	그에 따라 살균 트레이의 실리콘 핀 매트에서 손으로 자릅니다.
TgBAC(gfap:gfap-GFP) zf167(AB) 균주	KIT, 카를스루에, 독일	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
트리스 완충 식염수(TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, 스위스	P5912
안저 레이저 렌즈	Ocular Instruments, 벨뷰, 워싱턴, 미국	의2-0

트 년 (영문)