Real-Time Cyclic Adenosine Monophosphate Assay를 사용한 Odorant Receptor Activation 측정

초록

출처: Zhang, Y. et al., 실시간 cAMP 분석을 사용한 냄새 수용체 활성화의 생세포 측정. J. Vis. 특급.(2017년)

이 동영상은 cAMP(cyclic adenosine monophosphate) 바이오센서 및 발광 검출을 사용하여 형질 주입된 세포에서 냄새 수용체 활성화를 측정하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법은 후각 뉴런의 수용체-리간드 상호 작용 및 신호 경로를 연구하는 데 적용됩니다.

프로토콜

1. Real-Time cAMP Assay를 사용한 자극 및 냄새 수용체(OR) 활성 측정

1. 위상차 현미경으로 형질주입된 세포를 관찰하여 웰당 50-80%의 적절한 합류를 확인하고 인큐베이터로 돌아갑니다.
2. Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)에 10mM 하이드록시에틸 피페라진에탄술폰산(HEPES)과 5mM 포도당을 첨가하여 자극 배지를 준비합니다.
3. 실시간 cAMP 분석 기질 시약 부분 표본을 얼음 위에서 해동합니다. 기질 시약을 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에서 튜브당 55μL로 -80°C에서 보관하십시오. 플레이트당 튜브 1개를 사용하십시오.
4. 55μL의 기질 시약과 2750μL HBSS/HEPES/포도당 용액을 혼합하여 2% 평형 용액을 준비합니다.
5. 벤치에 두꺼운 종이 타월을 펴십시오. 종이 타월에 플레이트를 거꾸로 부드럽게 반복해서 두드려 트랜스펙션 매체가 완전히 흡수되도록 합니다.
6. 각 웰에 50μL의 HBSS/HEPES/포도당 용액을 피펫팅하여 세포를 세척합니다.
7. 96웰 플레이트에서 HBSS/HEPES/포도당 용액을 부드럽고 반복적으로 두드려 꺼냅니다.
8. 25μL의 2% 평형 용액을 각 웰에 피펫팅하고 실온에서 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다.
9. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 1M 취취 원료 용액을 미리 준비하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
10. 배양 시간이 끝나기 전에 착취 물질 원료 용액을 HBSS/HEPES/포도당 자극 매체의 작업 농도로 희석합니다.
    메모: 이 단계에서 준비된 냄새 희석액의 농도는 각 웰에서 올바른 최종 농도를 산출하기 위해 두 배로 증가해야 합니다.
11. 화학발광 플레이트 리더를 사용하여 취취제를 첨가하기 전에 웰당 1000ms의 속도로 2회 연속 플레이트의 기저 발광 수준을 측정합니다.
12. 플레이트 리더에서 플레이트를 빠르게 제거하고 각 웰에 25μL 냄새 희석액을 추가한 다음 30분 이내에 20주기 동안 모든 웰의 연속 발광 측정을 즉시 시작합니다
    메모: 동일한 플레이트에서 다른 냄새 물질 및/또는 동일한 냄새 물질의 다른 농도를 사용할 때 이웃 우물이 오염되지 않도록 조심스럽게 피펫팅하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
디엠소	시그마	D2650
GloSensor cAMP 시약	프로메가	1290회
HBSS, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음	지브코	14175095
헤페스	하이클론	SH30237
머스콘	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-200528
머스크 티베텐	시그마-알드리치	S359165
PBS, 칼슘 또는 마그네슘 없음	셀그로	21-040-이력서
0.2-mL PCR 튜브	액시겐	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf 튜브	에펜도르프
15mL 17mm x 120mm 코니컬 튜브	BD 팔콘	352096
8웰 및/또는 12웰 멀티채널 피펫맨	에펜도르프
96웰 바닥이 평평한 백색 세포 배양 플레이트	그라이너	655098
100mm x 20mm 세포 배양 접시	BD 팔콘	353003
인피니트 F200 플레이트 리더	테칸