Ion-Selective and Iontophoresis microelectrodes를 사용한 뇌 절편의 세포외 공간 특성화

Abstract

출처: Odackal, J., et al. 테트라메틸암모늄을 사용한 실시간 이온영동으로 뇌 세포 외 공간의 부피 분율 및 비틀림을 정량화합니다. J. Vis. 특급 (2017년)

이 동영상은 이온 선택성 및 이온 영동 미세전극을 사용하여 전기 신호를 측정하고 비교함으로써 뇌 절편의 세포 외 공간을 특성화하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스는 공간의 부피 분율과 비틀림 정도를 결정하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. Brain Slices의 실시간 Iontophoresis

1. 400μm 두께의 뇌 절편을 기록실에 넣고 흐르는 인공 뇌척수액(ACSF)에 완전히 잠기도록 합니다. 수채화 붓을 사용하여 조각을 배치하고 그리드로 부드럽게 고정합니다.
2. iontophoresis microelectrode와 ISM을 모두 뇌 절편의 관심 영역 위로 이동합니다. 흐르는 ACSF와 슬라이스 위에 모두 담그십시오.
3. 레퍼런스 및 이온 감지 채널 모두에 대한 전압을 "0" mV로 오프셋합니다. 두 채널의 전압이 안정화될 때까지 기다립니다. 차트 레코더에서 ISM의 이온 감지 채널에서 측정된 전압을 표시합니다. 이를 사용하여 Wanda의 기준 V 매개 변수를 계산합니다.
4. ISM과 iontophoresis 미세전극을 슬라이스에 200μm 깊이, 서로 120μm 떨어진 곳에 놓습니다. 미세 전극을 뇌 절편으로 이동한 후 신호가 안정화될 때까지 기다립니다.
   메모: iontophoresis 미세 전극에 적용되는 바이어스 전류는 테트라메틸암모늄(TMA)의 소량 축적을 유발합니다. 너무 빨리 녹음을 하고 신호 축적을 과소평가하는 것은 흔한 실수입니다.
5. 차트 레코더에서 ISM의 이온 감지 채널의 브레인 슬라이스에서 측정된 안정화된 전압을 표시합니다. 8.3단계와 8.4단계에서 측정한 TMA 신호 간의 전압 차이를 계산하고 이 값을 Wanda GUI의 측정 전극 상자의 "기준선 V(mV)" 필드에 입력합니다.
6. GUI의 왼쪽에서 모든 실험 매개변수가 올바르게 기록/입력되었는지 확인합니다. "Medium"을 "Brain"으로, "Transport number"를 7.4단계에서 iontophoresis microelectrode에 대해 계산된 평균값으로, "Temperature"를 slice.
   알림: 각 측정 세트에 대해 V를 기록해야 합니다. 기준선 V는 Wanda에 의해 기준선 C(mM) 매개변수(즉, 뇌 조직의 TMA 농도)로 변환됩니다.
7. "Acquire(획득)"를 클릭하여 녹음을 시작하고 전체 녹음을 허용합니다. TMA 신호가 기준선으로 돌아올 때까지 기다렸다가 새 녹음을 획득합니다.
8. 선택한 뇌 위치에서 미세 전극을 제거하기 전에 2-3개의 연속 녹음을 수행합니다. 각 녹음 직전에 측정된 온도를 Wanda 소프트웨어에 입력합니다.
9. 두 미세 전극을 대각선으로 슬라이스 표면으로 다시 이동합니다. 둘 다 슬라이스에서 최소 50μm 위로 올립니다. 차트 레코더를 사용하여 지금 측정된 V와 8.3단계에서 측정한 값 사이의 변화를 확인합니다.
10. ISM의 팁과 이온 동동 미세전극을 x축, y축 및 z축에서 서로에 대해 중심을 맞춥니다. micromanipulator control box의 디스플레이에서 간격 변경 사항(있는 경우)을 가져옵니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ISM용 증폭기	다간	모델 IX2-700 듀얼 세포 내 프리amp리퍼	N=0.1(기준 배럴용) 및 N=0.001(이온 배럴용) 헤드스테이지의 이온 및 기준 전압 증폭기
생물학적 화합물 현미경(4x 및 10x 대물렌즈 포함)			미세 전극 팁을 치핑하고 미세 전극을 검사하기 위해; 다양한 공급업체, 예: AmScope
붕규산 THETA 모세관 유리관	하버드 기구	Warner Instruments 모델 TG200-4; 주문 #64-0811	이온 선택성 미세전극 및 이온영동 미세전극을 위한 이중 배럴 유리관; 외경 2.0mm, 내경 1.4mm, 격막 0.2mm, 길이 10cm
차트 레코더			테트라메틸암모늄 표준에서의 보정 중 및 RTI 실험 중에 이온 선택형 미세전극의 전압을 연속적으로 기록하기 위해; 예: Kipp & Zonen 타입 BD112 듀얼-캐널 차트 기록, 리퍼브 상품 사용 가능
상용 소프트웨어	매스웍스	MATLAB, 데이터 수집 툴박스	Wanda 및 Walter 프로그램을 사용한 데이터 수집 및 분석. 교육용 라이센스를 사용할 수 있습니다.
눈 보호 고글	어부
고정 스테이지 복합 현미경	올림푸스	BX51WI	고정 스테이지가 있는 다른 복합 현미경을 사용할 수 있습니다.
집게	정밀 과학 도구	#의 11251-10	유리 모세관을 잘게 썰기 위해; Dumond #5, 가급적 사용되며 더 이상 미세 작업에 필요하지 않음
iontophoretic 단위	다간	ION-100 및 PS-100	ION-100은 단일 채널 이온 영동 장치 +/- 130V 준수입니다. PS-100은 외부 전원 공급 장치입니다. 대안 제품: 예: Axon Instruments(현재 Molecular Devices)에서 만든 Axoprobe-1A, 생산 중단, 리퍼브 장치의 가용성 확인(eBay 및 기타 사이트)
마이크로 전극 홀더	WPI (영어)	M3301EH	이온 선택적인 microeletrode를 미리 조립식으로 만드는 보전되기 위하여는, silanization 및 액체 이온 교환기로 이온 선택적인 배럴의 끝을 채우기; WPI는 이 홀더의 두 가지 버전, 즉 클리어 M3301EH와 블랙 M3301EH를 판매합니다. 우리의 경험에 따르면 맑은 M3301EH이 검은 M3301EH보다 더 견고한 것 같습니다.
마이크로 매니퓰레이터	나리시게	음-3	이온 선택성 microelectrode를 silanization 도중 조립식으로 만들고 액체 이온 교환기로 이온 선택성 배럴의 끝을 채우기 위하여 제조하십시오; 좋은 근무 상태에 있는 어떤 3 축선 micromanipulator든지로 대용될 수 있습니다
대물렌즈: 5X 건조	올림푸스	MPlan N
목표: 10x Water Immersion	올림푸스	UMPlan 플로리다 N	10x 대물렌즈는 침수, 개구수는 0.3, 작동 거리는 3.3mm입니다.
고정형 현미경을 위한 플랫폼 및 X-Y 변환 스테이지	엑스포	지브롤터 버레이	플랫폼은 슬라이스 챔버, 마이크로 매니퓰레이터 및 액세서리를 수용하며, X-Y translational stage는 레코딩 안정성을 손상시키지 않고 현미경을 움직입니다
정확한 X, Y, Z 포지셔닝을 제공하는 로봇 미세 조작기	셔터 기기	MP-285	이온 선택성 미세전극과 이온영동 미세전극을 별도로 유지하기 위해 두 개의 미세조정기가 필요합니다. 또한 마이크로피펫을 간격 배열로 접착할 수 있습니다(텍스트 참조).
저역 통과 필터가 있는 신호 조정 장치	축삭 기기	사이버 앰프 320 또는 380	제조업체에서는 더 이상 구할 수 없지만 E-Bay에서 구할 수 있습니다. 대안: 예: Cygnus Technology의 FLA-01 필터/증폭기. 이 기기는 다극 베셀 필터를 사용하여 10Hz에서 최소 차단이 가능한 단일 채널 기기이지만, 필요한 경우 더 낮은 차단 주파수(2Hz)로 수정할 수도 있습니다.
실버 와이어	A-M 시스템	#의 7830	직경 0.015", 베어(코팅 없음)
슬라이스 챔버	하버드 기구	워너 모델 RC-27L	이것은 침수 슬라이스 챔버입니다. 인터페이스 슬라이스 챔버를 사용하지 마십시오
실체현미경			Silanization와 액체 이온 교환기로 이온 선택적인 배럴의 끝을 채우기를 위해; 수평으로 거치하는; 각종 공급자
테트라메티암모늄(TMA) 클로라이드	시그마-알드리치	T-3411	5M 용액; 주의: 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 발암성, 수생 환경에 유해함, 전체 설명은 Sigma-Aldrich 안전 정보 참조