아밀로이드-베타 펩타이드 주입을 통한 알츠하이머병 쥐 모델 구축

초록

출처: Xiaoguang, W., et al. 복합 아밀로이드 베타 단백질의 뇌실 주입에 의한 쥐 동물 모델에서 알츠하이머 병의 가치있는 모방체의 확립. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 해마 부위의 독성 아밀로이드 플라크 형성을 총체적으로 돕는 아밀로이드-베타 펩타이드, 염화알루미늄 및 신경염증 성장 인자를 주입하는 절차를 보여줍니다. 이것은 쥐에게 알츠하이머병의 특징인 기억력 장애를 일으킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 외과 수술 절차

참고: 20마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐에게 복합 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)을 외측심실 및 전방 시상핵에 미세주입하고 복합 Aβ 처리 그룹으로 지정했습니다. 또 다른 20마리의 쥐에게 동일한 수술을 실시하였으나 0.1% 디메틸설폭사이드(DMSO) 식염수 미량주입을 받고 가짜 수술 그룹으로 지정되었다.

1. 쥐를 100% 이소플루란으로 흡입하여 마취시킨 다음 뇌 입체 기구에 제
지합니다.
2. 수술 용 가위로 머리 꼭짓점의 털을 깎고 요오드로 소독합니다. 그런 다음 일회용 수술용 수건을 머리에 덮습니다.
3. 수술용 비스투리와 가위로 정중 세로 칼바리아를 따라 머리 피부를 절개합니다.
4. 피하 조직과 근막을 분리하고, 멸균 건조 면으로 두개골 칼바륨을 닦아 출혈을 멈춘 다음 마커 펜으로 브레그마를 표시합니다.
5. 브레그마를 원점으로 간주하는 Rat Brain Stereotaxic Map을 참조하고, 3개의 점, 전등 시상핵(ad)(후방(P): 브레그마까지 2.0mm, 측면(L): 정중선까지 1.4mm)을 표시하여 재조합 인간 형질전환 성장 인자-β1(RHTGF-β1)을 주입하고 나사 1개, 외심실(LV) 영역(후방(P): 브레그마까지 0.8mm; 아밀로이드 베타 단백질 25-35 (Aβ25-35) 및 삼염화알루미늄 (AlCl₃ )을 주입하기위한 측면 (L) : 정중선까지 2.0mm) 및 두 번째 나사 고정 장소 (전면 (F) : 브레그마까지 2.0mm, 측면 (L) : 정중선까지 1.5mm).
6. 두개골의 위 세 지점에 지정된 유연한 뼈 드릴로 직경 1mm의 구멍 3개를 부드럽게 뚫습니다(1.5. 단계). 뇌 조직을 찌르지 않도록 필요 이상으로 깊게 조이지 마십시오.
7. 출혈을 멈추고 멸균 마른 면으로 두개골 표면을 반복적으로 청소하십시오.
8. 마이크로 주입 펌프에 연결된 바늘을 4.6mm 깊이의 뇌에 삽입하고 광고 영역에 1μL RHTGF-β1(10ng)을 부드럽게 주입합니다. 주사 후 2분 동안 바늘을 그대로 두고 천천히 바늘을 빼냅니다.
9. 두 개의 나사를 광고 부분에 지정된 두개골에 고정하고 두개골의 두 번째 나사 고정 위치(1.5. 단계에서 지정됨)를 작은 드라이버로 고정합니다. 뇌 조직을 찌르지 않도록 필요 이상으로 깊게 조이지 마십시오.
10. 캐뉼라 이식 시스템을 조립하고 고압으로 소독한 후 더미 캐뉼라를 가이드 캐뉼라에 삽입합니다.
11. 쥐의 정위 장치의 캐뉼러 홀더를 사용하여 두개골 구멍을 통해 LV 영역으로 4.6mm의 스테인리스 스틸 튜브 가이드 캐뉼러를 뇌에 삽입합니다.
12. 의치 베이스 재료와 의치 베이스 물을 1mL당 1.5g의 비율로 혼합하고, 가이드 캐뉼라 플라스틱 받침대를 덮을 페이스트를 넣고, 가이드 캐뉼라를 고정하고 피부 감염을 방지하기 위해 피부 절개 부위 전체를 덮을 수 있는 두 개의 나사를 넣습니다.
13. 수술 2일차에 쥐는 소동물 마취기를 사용하여 이소플루란 흡입으로 마취되었습니다. 더미 캐뉼러를 빼내고, 내부 캐뉼러를 가이드 캐뉼라에 삽입하고, 고정 나사를 조여 내부 캐뉼라를 고정합니다.
14. 미세주입 펌프를 내부 캐뉼라에 연결하는 폴리에틸렌 파이프를 설정하고 주입 속도를 1μL/min으로 조절합니다. Aβ25-35 또는 AlCl₃을 LV에 미세주입합니다.
15. 이소플루란 마취 하에 매일 4μg(1μL) Aβ25-35를 14일 동안 매일 14일, 오후에 5일 동안 매일 3μL AlCl₃(1%)을 미세
주입합니다.
16. 주입이 끝난 후 5분 정도 기다렸다가 내부 캐뉼라를 부드럽게 빼내고 더미 캐뉼러를 가이드 캐뉼라에 다시 삽입합니다.
17. 수술 후 15일째(Aβ25-35의 마지막 주사일에 해당)에 캐뉼라 이식 시스템을 분해합니다. 수술용 가위와 집게로 틀니를 부드럽게 제거하고 두 개의 나사를 풀고 가이드 캐뉼라를 당겨 베타딘으로 상처를 소독합니다. 두개골 구멍을 뼈 시멘트로 채우고 간단한 중단 봉합 방법을 사용하여 피부를 봉합합니다.
18. 가짜 수술 그룹과 동일한 작업을 수행하고 0.1% DMSO 식염수를 마이크로 주입합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Sprague-Dawley 쥐	베이징 Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, 중국	SCXK(징) 2012-0001	300–350 그램
이동식 소동물 마취	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	R580
뇌 입체 장치	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	68001
유연한 뼈 드릴	Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. 중국	흑백-sD908
투과 전자 현미경	Japan Co., Ltd. 일본	JEM-1400
2채널 microinjection 펌프	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	RWD202 (영문
EM 마이크로톰	Hitachi Co., Ltd. 중국	H-7650
더미 캐뉼러	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62001	0.D.0.64×내경0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
가이드 캐뉼러	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62101	0.D.0.40mm/M3.5
내부 캐뉼러	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62201	0.D.0.41×내경0.25mm/M3.5
너트를 조입니다.	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62501	0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
고정 나사	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62514	M1.2×L2.0mm(100바오)
스크루 드라이버	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62999	45*1 밀리미터
PE 튜빙	RWD 생명 과학 Co., Ltd. 중국	62302
아밀로이드 베타 25-35	시그마 알드리치, 미국	SCP0002-5MG
재조합 인간 형질전환 성장 인자-β1	PeproTech Inc. 미국	100-21
알루미늄 트리클로라이드	Tianjin Kemiou 화학 시약 Co., Ltd. 중국	3011080
인산아연 치과 시멘트	공장 Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. 중국의 치과 재료	201311

) 년 년