동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
C57BL/6 (H-2b) 암컷 마우스, 8주령을 구입하고 C57BL/6 AQP4-/- 마우스는 A. Verkman이 제공했습니다.
1. AQP4 펩티드를 사용한 마우스의 면역
- 완전한 Freund's adjuvant(CFA) 작업 재고를 준비합니다.
- 절구와 절굿공이를 사용하여 Mycobacterium tuberculosis(H37Ra)의 건조된 제제를 미세하게 분쇄합니다.
- 분쇄 H37Ra를 최종 농도 4mg/mL로 불완전한 Freund 보조제에 추가합니다. CFA는 4°C에서 최대 6개월까지 보관할 수 있습니다.
- 동결건조 항원(Ag) AQP4 펩타이드를 인산염 완충 식염수(PBS)에 최종 농도 1mg/mL로 용해시킵니다. 4°C 또는 얼음 위에서 유지하십시오.
- CFA/펩타이드 에멀젼이 포함된 마개로 결합된 2개의 루어락 주사기 조립을 준비합니다.
- 플런저가 없는 유리 루어락 주사기를 3개의 수 루어락 연결부가 있는 2방향 나일론 마개에 부착합니다. 레버를 주사기 쪽으로 전환하여 마개를 닫습니다. 주사기의 열린 끝을 위로 올려 주사기가 시험관 역할을 할 수 있도록 합니다. 안정성을 더하기 위해 이것을 튜브 랙에 넣으십시오.
- Vortex: CFA 작업 재고 및 Ag 솔루션. 오픈 시린지에 1:1 부피의 펩타이드/CFA를 첨가합니다. 마우스당 200μL의 CFA/Ag(4 x 50μL)가 필요합니다.
메모: 일반적으로 약 1mL의 제제가 마개에서 손실되어 예방 접종에 사용할 수 있는 양이 줄어듭니다. 따라서 필요한 총 부피 계산에 이를 통합하는 것이 중요합니다.
예: 5마리 마우스의 면역: (200μL/동물 x 동물 5마리) + 1mL 추가 부피 = 2mL 총 CFA/Ag 필요.
- 유리 플런저를 주사기에 삽입하고 제자리에 고정한 상태에서 마개가 위쪽을 향하도록 주사기를 뒤집습니다. 스톱콕 레버를 사용하지 않는 암 연결로 전환합니다. 주사기에서 과도한 공기를 제거하기 위해 유리 플런저에 조심스럽게 압력을 가하십시오. 액체는 마개의 두 번째 수컷 루어락 연결을 채웁니다.
- 두 번째 유리 주사기(플런저가 완전히 삽입됨)를 스톱콕의 두 번째 수 루어록 연결부에 부착합니다. 이것은 가능한 한 과도한 공기를 최소화하는 마개와 연결된 2개의 유리 주사기로 구성된 폐쇄형 시스템이어야 합니다.
- 에멀젼을 만들려면 플런저를 밀어 약 2 분 동안 2 개의 주사기 사이에 액체를 번갈아 가며 통과시켜 혼합합니다. 주사기를 얼음에서 약 10 분 동안 식히십시오. 제제의 점도에 명확한 변화가 생길 때까지 냉각 및 혼합을 반복하여 매우 뻣뻣한 흰색 에멀젼이 생성됩니다. 에멀젼이 함유된 주사기는 4°C에서 냉장 보관하거나 얼음 위에 보관하십시오.
- 모든 에멀젼을 하나의 유리 루어락 주사기로 옮기고, 빈 유리 주사기를 제거한 다음 주입용 1mL 루어락 주사기로 교체합니다. 새 주사기에 에멀젼을 채우고 마개에서 제거한 다음 바늘(25G x 5/8)을 부착합니다.
- 일관성을 위해 에멀젼을 "수질 테스트"합니다. 에멀젼 한 방울을 작은 물 접시에 떨어뜨립니다. 에멀젼은 분산되어서는 안 되며, 이는 주입에 적합함을 나타냅니다.
- 유화액이 분산되는 경우에, 주입 이 준비되어 있지 않습니다; 유리제 주사통으로 액체를 다시 옮기고 유화액이 뻣뻣할 때까지 섞고 그 후에 다시 식히는 것을 계속하십시오.
- 적절한 농도가 될 때까지 에멀젼을 다시 테스트하십시오.
- 기증자 AQP4-/- 마우스에 AQP4 펩타이드가 함유된 에멀젼을 피하(s.c.)로 주입합니다. 각 마우스는 4 x 50 μL s.c. 주사(총 200 μL(100 μg 펩타이드))를 받습니다. 4개의 부위는 서혜부 림프절(LN)로 배출되는 하복부의 양쪽과 각 겨드랑이 내측의 흉벽 양쪽을 포함하여 겨드랑이 LN으로 배출됩니다. 입양 이식에는 수혜자 마우스 당 1-2개의 면역된 기증자 마우스가 필요합니다.
2. T 세포 배양 및 전염증성 T 세포 분극
- 면역 후 10-12일 후에 생쥐에서 LN을 수집합니다.
- 얼음 트레이에 세포 여과기(메쉬 크기 70μm)가 장착된 60mm 페트리 접시와 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 100U/mL 페니실린-100μg/mL 스트렙토마이신(펜-스트렙)(RFPS)이 포함된 냉각된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지를 준비합니다.
- CO2에 노출되어 생쥐를 안락사시킨 다음 경추 탈구를 일으킵니다. 마우스를 70% 에탄올에 담근 다음 각 발판을 해부 보드에 고정합니다.
- 사타구니에서 목까지 정중선 피부 절개를 잘라 각 다리를 아래로 내립니다.복막에서 피부를 당겨 보드에 팽팽하게 고정합니다. 서혜부와 겨드랑이 LN을 해부하고 RFPS가 들어있는 페트리 접시에 얼음 위에 놓습니다.
- 입양 이식 실험의 경우, 동일한 면역 그룹 내의 모든 동물의 LN을 결합합니다. Vβ 사용에 대한 유세포 분석을 위해 개별 동물에서 LN을 분리합니다.
- LN이 들어 있는 세포 스트레이너를 RFPS가 들어 있는 50mL 원심분리 튜브에 놓습니다. 멸균 5mL 주사기 플런저의 평평한 끝을 사용하여 스트레이너를 통해 LN 세포를 누르고 20-30mL의 RFPS로 세척하여 세포의 회복을 용이하게 합니다. 배양 시간까지 가공 내내 얼음 위의 LN 세포를 유지하십시오.
- 2회 세척하고 393 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 두 번째 세척 후 T 세포 배지(TCM)에 LN 세포를 재현탁합니다. TCM에는 10% 열 비활성화 FBS가 포함된 RPMI, 292μg/mL L-글루타민, 110μg/mL 피루브산 나트륨, 55μM 2-메르캅토에탄올 및 펜 스트렙이 포함되어 있습니다. 일반적으로 공여체 마우스당 5mL TCM의 부피가 사용됩니다.
- LN 셀을 계산합니다. 예상 수율은 면역된 마우스 공여자당 약 3-6 x 107 LN 세포입니다.
- 입양 이식을 위한 편광 배양을 설정합니다.
- TCM에서 10 μg/mL Ag, 20 ng/mL 재조합 마우스 인터루킨(IL)-23 및 10 ng/mL 재조합 마우스 IL-6을 사용하여 mL당 5 x 106 LN 세포의 Th17 편광 배양을 준비합니다.
- 또는 Th1 분극의 경우 TCM에서 10 μg/mL Ag 및 10 ng/mL 재조합 마우스 IL-12를 사용하여 mL당 5 x 106 LN 세포의 배양을 준비합니다.
- 편광 배양 혼합물의 웰당 2mL(1 x 10,7 세포)를 12웰 플레이트에 추가합니다. 2-4 기증자 마우스의 LN 세포는 하나의 12-well 플레이트를 채울 것입니다. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2로 72시간 동안 배양물을 유지합니다.
- 48시간 및 72시간에서 배양액 중인 LN 세포의 활성화를 육안으로 확인합니다.활성화된 세포는 광범위한 클러스터를 형성하고 T 세포는 크기가 증가하여 더 다형성이 됩니다. 신진대사가 증가하면 배지의 pH가 낮아져 복숭아색에서 주황색으로 변합니다. pH가 매체를 황색으로 변할 만큼 충분히 낮으면 나머지 24시간 동안 세포에 대한 독성을 방지하기 위해 1mL의 신선한 TCM을 추가합니다.
- 입양 이전을 진행합니다.
3. 병원성 AQP4 특이적 T 세포의 입양 전달
참고: 이 단계는 섹션 2.5: T 세포 배양 및 전염증성 T 세포 분극에서 따릅니다.
- 12-well 플레이트에서 편광된 세포를 위아래로 피펫팅하여 분리하고 50 mL 튜브로 옮겨 회수합니다. 주사할 때까지 얼음 위에서 유지하십시오.
- 세포를 세고 차가운 PBS에서 두 번 세척한 다음 PBS에서 1 x 108 cells/mL의 현탁액을 준비합니다. 일반적으로 한 시간 이내에 세포를 주입하십시오.
- 세포를 빙빙 돌려 부드럽게 혼합하고 주입 시 1mL 주사기에 옮깁니다. 200μL의 세포(2 x 107)를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 정맥(i.v.) 투여합니다.
- 각 수용 마우스에 200ng의 B. 백일해 독소 200ng을 그날 및 2일 후에 PBS 200μL에 희석하여 주입합니다. 임상 질환의 징후가 있는지 매일 마우스를 모니터링하십시오.
