Immunofluorescent staining of neuronal populations in the embryonic murine gastrointestinal tract(배아 쥐 위장관에서 신경 세포 집단의 면역형광 염색)

초록

출처: Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunostaining to Visualize Murine 장 신경계 발달. J. Vis. 특급. (2015년)

이 비디오는 면역형광 및 컨포칼 현미경을 사용하여 신경 세포 집단 분포를 시각화하고 분석하기 위해 배아 쥐 위장관의 면역 염색을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 면역 염색 프로토콜

1. 샘플이 30% 자당에 보관된 경우 흔들 플랫폼에서 1x PBS에서 20분 동안 3번 헹굽니다.
2. GI 관을 RT에서 1시간 동안 흔들리는 플랫폼의 차단 용액에 놓습니다.
3. 차단 용액을 제거하고 차단 용액에 희석된 적절한 양의 1차 항체로 위장관을 실온 4시간 또는 흔들 플랫폼에서 4°C의 O/N 동안 배양합니다. human anti-Hu 항체(환자로부터 얻은 혈청)를 1:1,000 희석, 닭 anti-green 형광 단백질(GFP) 항체를 1:1,000 희석, 염소 anti-ChAT 항체를 1:100 희석하여 사용합니다.
   메모: 우리는 환자로부터 국소적으로 얻은 인간 항 Hu 항체를 사용합니다. 그러나, 항-Hu 항체, 예를 들어 마우스 anti-Hu(1:500 희석에서 사용)와 같은 상용화되어 있다.
4. 위장관을 1x PBS로 3회 5분 동안 헹구고 나서 흔들 플랫폼에서 RT로 1시간 동안 헹굽니다.
5. 1x PBS를 RT에서 4시간 또는 4°C에서 O/N을 위해 흔들 플랫폼에서 차단 용액에 1:500으로 희석된 2차 항체로 교체합니다. Dylight, 당나귀 안티 치킨 Cy2 및 당나귀 안티 염소 Cy5와 같은 당나귀 항인간 아민 반응성 염료를 사용합니다. 마우스 anti-Hu 항체를 사용하는 경우 당나귀 anti-mouse amine-reactive dye 405.
   를 1:500 희석하여 사용하십시오. 메모: 내인성 GFP 및 tdTomato 발현의 강도와 면역염색의 투명도는 발달 연령에 따라 증가합니다. 우리는 일반적으로 사용되는 항체의 양을 줄이고 조직의 효율적인 염색을 보장하기 위해 150μl의 염색 용액이 있는 0.2ml 튜브에 배아 내장을 개별적으로 면역염색합니다.
6. 위장관을 1x PBS로 3회 5분 동안 헹구고 나서 흔들 플랫폼에서 RT로 1시간 동안 헹굽니다.
7. DAPI가 있는 형광 장착 매체 몇 방울을 유리 슬라이드에 놓습니다. 위장관을 형광 장착 매체에 담그고 조직 바로 위에 커버 유리를 추가합니다. 형광 장착 매체 -G는 반영구적 밀봉을 제공하는 수용성 화합물입니다 .
   메모: Vectashield와 같은 형광 장착 매체를 사용하여 항체 변색 및 광표백을 방지하는 글리세롤 기반 장착 매체를 사용합니다. 이 두 제품 모두 조직을 4°C에서 장기간 보관할 수 있습니다.
8. 컨포칼 현미경을 사용하여 각 형광단의 이미지를 캡처합니다. 표 1에 사용된 fluorophores 및 filter에 대한 excitation 파장을 사용합니다.
9. 이미지를 캡처하는 데 사용되는 공초점 유형에 따라 적절한 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 지원 이미지 분석을 수행합니다.

표 1: 컨포칼 이미징 여기 파장, 형광단 및 필터. excitation 파장, 검출 가능한 형광단 및 사용된 필터가 제시됩니다. 이 정보는 다색 면역형광을 위한 2차 항체 조합을 선택하는 데 사용할 수 있습니다.

개 개 개

여기			방출
레이저 라인	형광단 유형	예제	광전자 증배관	필터 옵션
408 nm의	파랑	Alexa Fluor 405, 캐스케이드 블루, 쿠마린 30, DAPI, Hoechst, 퍼시픽 블루, 대부분의 퀀텀 닷	1	BP 425-475 nm
488 nm의	녹색	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, 오레곤 그린, YO-PRO-1	2	BP 500-550 nm
561 nm의	빨강	Alexa Fluor 546, 555, 568 및 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoerythrin(PE), Propidium Iodine(PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nm의
638 nm의	원적색	Alexa Fluor 633 및 647, 알로피코시아닌(APC), Cy5, TO-PRO-3	4	혈압 663-738 nm

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수	옥소이드	BR0014G
소 세럼 알부민	어부	BP1605
트리톤 X-100	시그마	엑스100
형광 범위	니콘	SMZ-18 스테레오스코프
1.5 mL Eppendorf 튜브	폭스바겐	20170-038
플루오로마운트-G	SouthernBiotech, 앨라배마주 버밍엄	제0100-01
유리 슬라이드	어부	제12-550-15
커버 유리	폭스바겐	제16004-330
컨포칼 현미경	니콘	니콘 A1
Nikon 요소	니콘

년 호 호 호