알파 Synuclein 섬유의 주입을 통해 쥐에 있는 neuroinflammation의 감응작용

초록

출처: Breid, S. et al. alpha-synuclein fibrils의 말초 접종 후 형질전환 마우스의 신경 염증에 대한 생물 발광 이미징. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 신경 염증을 유도하기 위해 알파-시누클레인 피브릴을 마우스에 주입하는 방법을 보여줍니다. 원섬유는 돌연변이된 알파-시누클레인 단백질을 발현하는 형질전환 마우스에 복강내로 주입됩니다. 중추신경계에 도달하면, 원섬유는 뉴런으로 들어가 돌연변이된 단백질의 응집을 유도합니다. 응집체는 인접한 뉴런, 미세아교세포 및 성상세포로 퍼집니다. 응집체의 인식은 미세아교세포를 유발하여 신경 염증을 유발하여 뉴런을 손상시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 모델

1. 반구형 Tg(M83^+/-) 마우스(가족성 A53T 돌연변이를 가진 인간 알파-시누클레인을 발현하는 형질전환 마우스)와 교배 반접합성 Tg(Gfap-luc^+/-) 마우스(반딧불이 루시퍼라제를 발현하는 형질전환 마우스)를 사용하여 반접합성 Tg(M83^+/-:Gfap-luc^+/-) 마우스를 생성합니다.
2. 인간 알파-시누클레인을 암호화하는 전이유전자의 존재에 대한 실시간 폴리엠라제 연쇄 반응(PCR)과 반딧불이 루시퍼라제에 대한 표준 PCR을 사용하여 자손을 유전자형화합니다.
3. 생후 6주에서 8주 사이에 동물에게 접종합니다.

2. 접종 준비

1. 53mM Tris-HCl(pH 150)에서 20mM NaCl을 포함하는 Tris-완충 식염수(TBS) 완충액에서 A7.2T 돌연변이가 있는 단량체 재조합 인간 알파-시누클레인을 준비합니다.
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2. 일 동안 800rpm 및 37°C의 궤도 셰이커에서 3μg/μL의 단량체 재조합 인간 알파-시누클레인을 교반하여 접종을 위해 섬유소 알파-시누클레인을 준비합니다.
3. 복강내 접종을 위해 1 μg/μL의 최종 농도에 도달하기 위해 인산염 완충 식염수(PBS)에서 피브릴 어셈블리를 희석합니다.
4. 얼음 위에서 막대 초음파 처리기로 알파-시누클레인 원섬유를 1분 동안 조각화합니다(각 펄스 사이에 1초의 일시 중지와 진폭을 50%로 설정한 0.5초 동안의 펄스 40개). 교차 파종으로 인한 오염을 방지하려면 깨끗한 초음파 처리 프로브를 사용하여 다른 접종물을 준비하십시오.

3. 복강내 주사

1. 복강 내 주사의 경우, 2L/min의 유속으로 이소플루란/산소를 흡입하고 기화기를 2%로 설정하여 마취실에서 동물을 즉시 마취시킵니다. 동물의 발가락을 꼬집고 적절한 마취를 위해 뒷다리를 빼지 않는지 확인합니다.
2. 27G의 일회용 피하 주사기에 50μL의 초음파 처리된 알파-시누클레인 피소 또는 PBS를 채웁니다.
3. 마우스의 복막에 직접 주입하고 머리가 조사자로부터 반대쪽을 향하고 약 45°에서 아래쪽을 향하도록 동물을 등쪽 자세로 잡고 복벽 뒤에 위치한 소장이나 맹장을 관통하지 않도록 합니다. 동물이 마취에서 회복될 때까지 동물을 모니터링합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수(PBS)	인비트로젠	14190169
27게이지 주사기	폭스바겐	전화: 613-4900
이소플루란	피라말 헬스케어	PZN 4831850
Sonopuls Mini20 초음파 처리기	반델린	3648
Tg(M83+/-) 마우스 또는 B6; C3-Tg(PrnpSNCA*A53T)83Vle/J 마우스	잭슨 연구소	4479