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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV) 생산 및 정제
참고: rAAV 벡터 생성 및 정제는 Leuven Viral Vector Core(LVVC)에 의해 수행되었습니다.
- 간략하게, DMEM 배지 2% 소 태아 혈청에서 25kD 선형 폴리에틸레민 150 nM NaCl 트랜스펙션 용액과 3개의 서로 다른 플라스미드를 1:1:1 비율로 사용하여 subconfluent low(<50) 계대 부착 HEK 293T 세포를 transfection합니다. 5% CO2 에 있는 37 °C에 24 시간의 배양 후에, 매체를 신선한 DMEM 매체 2% 소 태아 혈청으로 교체하십시오.
메모: 플라스미드는 AAV7 혈청형, CMVie enhanced synapsin1 promoter의 제어 하에 human A53T 돌연변이 alpha-synuclein(α-SYN)을 인코딩하는 AAV 전달 플라스미드 및 pAdvDeltaF6 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 포함합니다.
- 일시적인 transfection 후 5일 후에 배지를 수확하고 접선 흐름 여과를 사용하여 농축합니다.
- 요오딕산올 계단식 구배를 사용하여 농축된 배지에서 rAAV 벡터 입자를 정제합니다.
- 게놈 복제(GC) 측정을 위해 Real-Time PCR의 표준 기술을 사용합니다. 이 프로토콜에서는 3.0 E11 GC/ml의 벡터 역가를 사용하여 파킨슨병(PD)에 대한 α-SYN 기반 랫트 모델을 개발했습니다.
2. 쥐의 substantia nigra (SN)에서 rAAV α-SYN Vector의 정위 주입 (그림 1)
8- 주 된 암컷 Wistar 쥐를 수용하려면 약 200-250g의 무게가 나가는 일반 12시간 명암 주기에서 펠릿 음식과 수돗물을 무료로 이용할 수 있습니다.
- 케타민(60mg/kg)과 메데토미딘(0.4mg/kg)의 혼합물이 포함된 복강내(IP) 마취에 쥐를 제출합니다. 쥐가 마취되고 다른 발을 쥐어짜도 반응하지 않으면 마이크로 트랜스폰더 임플란터를 사용하여 추가 인식을 위해 쥐의 등에 마이크로 트랜스폰더를 피하로 투여합니다. 마이크로 트랜스폰더가 올바른 위치에 있고 판독 장치에서 읽을 수 있는지 확인하십시오.
- 두피 위쪽의 머리카락을 자릅니다. 두피와 귀 모두에 국소 마취제를 바르십시오. 무균 기술을 사용하여 층류 하에서 나머지 수술 절차를 수행합니다.
- 두 개의 이어바, 입, 코 바를 사용하여 쥐를 정위 머리 프레임에 놓습니다. 체온이 떨어지지 않도록 쥐의 몸을 종이 담요로 덮으십시오. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안구 윤활제를 바르십시오.
- 조듐 1%, 이소프로판올 70%로 두피를 소독하고 두피 정중선을 작게 절개합니다. 두개골의 막을 부드럽게 긁어내고 식염수로 헹굽니다. 두개골을 몇 분 동안 말리십시오. 두개골 봉합사와 두 개의 기준점인 Bregma와 Lambda를 관찰하십시오.
- rAAV 벡터를 SN에 주입하려면 브레그마(Bregma)를 향한 좌표를 정의합니다(경막에서 계산된 전후: 5.3mm, 내측: 2.0mm, 배복부: 7.2mm).
메모: 각 관심 영역에 대한 3차원 좌표는 쥐 뇌의 입체 지도책을 사용하여 계산하고 Bregma를 해부학적 기준점으로 적용할 수 있습니다.
- 10μl 미세주입 주사기(30게이지 20mm)에 rAAV 벡터를 채우고 전동식 미세주입 펌프에 연결된 입체계 기기에 넣습니다. 벡터 한 방울을 방출하여 부피를 조절하고 pH 9의 다가 세척 세제(예: RBS)로 제거합니다.
- 머리가 헤드 프레임에 똑바로 고정되어 있는지 육안으로 확인하고 좌우 축을 평가합니다. Bregma와 Lambda의 전후 및 내측 좌표를 시각적으로 주의 깊게 정의하고 정위 프레임의 배복부 팔에 있는 30게이지 20mm 바늘을 사용하여 높이를 측정합니다.
- Bregma와 Lambda 사이의 높이 차이는 최대 0.3mm입니다. 바늘을 Bregma에 다시 놓고 정위 프레임의 전후 및 중간 팔을 움직여 전후 및 내측 좌표를 적용합니다.
- 주사 부위에서 두개골의 높이를 측정하고 Bregma의 높이와 0.3mm 이상 차이가 나지 않는지 확인하십시오. 두개골에 직경 약 2mm의 구멍을 뚫습니다. 경막의 높이를 측정하며, 이는 배복부 좌표를 적용하기 위한 참고 자료로 사용됩니다. 또는 두개골의 고정 두께(0.9mm)를 뺍니다.
- 26게이지 바늘을 사용하여 경막을 관통하고 멸균 조직으로 혈액을 흡수합니다. 계속하기 전에 모든 출혈이 멈출 때까지 기다리십시오.
- 벡터 용액이 미리 로드된 10μl 미세주입 주사기를 미리 결정된 깊이(배복부 좌표)까지 뇌에 천천히 삽입합니다. 바늘을 제자리에 놓고 1분 동안 기다립니다. 0.25μl/min의 처리량으로 전동 미세주입 펌프를 사용하여 3μl의 벡터 용액(3.0 E11 게놈 copies/ml/ml(중간 벡터 용량) 또는 1.0 E12 GC/ml(높은 벡터 용량)의 rAAV2/7 α-SYN 또는 eGFP 제어 벡터)을 주입합니다.
- 주사 후 바늘을 5분 더 제자리에 두었다가 천천히 제거하십시오. 코팅된 꼰 폴리에스터 3.0을 사용하여 두피를 꿰매고, 70% 이소프로판올에 1% 조듐으로 소독한 다음 정위 기구에서 동물을 부드럽게 제거합니다. 먼저 코와 입 바를 푼 다음 두 개의 이어 바를 풉니다.
- 마취를 되돌리려면 쥐에게 0.5mg/kg 아티파메졸을 복강내 주사하고 쥐가 깨어날 때까지 38°C의 가열판에 깨끗한 케이지에 쥐를 놓습니다. 체온이 떨어지는 것을 방지하기 위해 쥐를 종이 담요로 덮으십시오.
- 처음 몇 시간 동안은 음식과 물에 쉽게 접근할 수 있습니다. 처음 며칠 동안 쥐를 모니터링하십시오. 필요한 경우 analgesia.
를 적용하십시오.
메모: 두개골에서 실밥을 제거할 필요가 없습니다. 1-2 주 후에 두개골이 완전히 수리되고 실밥이 느슨해집니다.
