Isolation of Detergent-Insoluble Protein Aggregates From Human Postmortem Brain Tissue

초록

출처: Diner, I., et al. Enrichment of Detergent-inoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 냉동된 사후 인간 뇌 조직에서 세제 불용성 단백질 응집체를 분리하고 농축하는 과정을 설명합니다. 이는 균질화, 세제 처리, 초음파 처리 및 초원심분리를 포함한 주요 단계를 보여주어 불용성 응집체를 분리하고 정제합니다. 마지막 단계는 추가 분석을 위해 요소 완충액에서 응집체를 용해하는 것입니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 균질화 및 분획

1. 조직 선택
   참고: 건강한 대조군(Ctl)과 병리학적으로 확인된 AD 사례(n=2)로 인한 동결된 사후 전두엽 피질 조직이 선택되었습니다. 아밀로이드 플라크 분포에 대한 사후 신경병리학적 평가는 컨소시엄 to Establish a Registry for Alzheimer's Disease 반정량적 채점 기준에 따라 수행되었지만, 신경섬유다발 병리학은 Braak 병기 결정 시스템에 따라 평가되었습니다.
   1. 건강한 대조군(Ctl) 및 병리학적으로 확인된 AD 사례에서 동결된 사후 뇌 조직을 얻습니다. 드라이 아이스, 집게 및 면도날 용기를 사용하여 타르가 달린 일회용 계량 보트에서 각 조직 샘플에서 ~ 250mg 부분의 회백질을 절제하고 조직이 해동되지 않도록 주의하십시오. 균질화할 각 조각의 무게를 기록합니다.
   2. 250 mg의 회백질을 겸자와 면도기를 사용하여 외부 회백질과 내부 백질 사이의 계면을 육안으로 검사하여 절제합니다. 백질, 더 중요한 것은 큰 혈관이나 혈액이 많은 부위, 수막 또는 거미막을 피하십시오. 뇌 조직이 있는 계량 보트를 드라이아이스가 있는 폴리스티렌 용기에 빠르고 자주 넣어 절단 과정에서 조직을 동결 상태로 유지하십시오.
   3. 분석 저울을 사용하여 각 동결 조각에서 절제된 회백질의 정확한 중량을 기록합니다. dounce 균질화(5mL/g 또는 20% w/v)에 필요한 저염(LS) 완충액(표 1 참조)의 부피를 계산합니다.
   4. 1x 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일과 함께 10mL LS 완충액을 준비하고 얼음에서 식힙니다.
   5. 드라이 아이스에서 계량된 티슈와 계량 보트를 제거하고 해동될 때 약 2 x 2mm 조각으로 깍둑썰기합니다. 얼음을 타고 미리 냉각된 2mL dounce homogenizer 튜브로 옮깁니다.
   6. 5 mL/g(20% w/v)의 얼음처럼 차가운 저염(LS) 완충액을 1X 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일과 함께 추가합니다.
   7. 높은 클리어런스 유봉 A를 약 10스트로크, 낮은 클리어런스 유봉 B를 15스트로크를 사용하여 얼음 위에서 뇌 조직을 균질화합니다.
   8. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 모든 균질산물을 2mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 튜브에 "TH"(Total Homogenate), 조직 케이스 번호 및 균질화 부피를 표시합니다. 0.8mL를 라벨이 부착된 1.5mL 튜브에 분주합니다. 과잉 균질산염도 유사하게 분주하여 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.
   9. 각 0.8mL 분취액에 각각 5M NaCl 및 10%(w/v) 사르코실 100μL를 각각 0.5M 및 1% w/v의 농도로 첨가합니다. 튜브를 반전으로 잘 섞고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 튜브에 "TH-S"(Total Homogenate-Sarkosyl)를 표시하여 균질액이 사르코실 완충액에 있음을 나타냅니다(표 1).
   10. 마이크로팁 프로브를 사용하여 얼음 위에서 30% 진폭(최대 강도 = 40%)으로 각 튜브를 3개의 5초 펄스로 초음파 처리합니다.
   11. 비신초닌산(BCA) 분석 방법을 사용하여 균질액의 단백질 농도를 측정합니다.
       메모: 조직 그램 당 5 mL LS로 제조 된 TH-S 균질액의 평균 단백질 농도는 15-20 mg / mL입니다. 균질액은 즉시 분별하거나 사용할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
   12. 1x 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제와 함께 얼음처럼 차가운 사크 완충액(표 1)을 사용하여 TH-S를 10mg/mL로 희석합니다.
   13. 각 TH-S 균질화 단백질 5mg(0.5mL)을 500μL 폴리카보네이트 초원심분리 튜브로 옮기고 sark-buffer와 쌍을 이룹니다. 180,000 x g의 예냉 로터와 초원심분리기에 튜브를 4°C에서 30분 동안 로드합니다. 사르코실 용해성 상등액(S1)을 1.5mL 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관합니다.
       참고: (세척 옵션) 세제 불용성 분획(P1)이 들어 있는 초원심분리 튜브에 200μL의 사크 버퍼를 추가하고 200μL 피펫 팁을 사용하여 초원심분리 튜브 바닥에서 펠릿(P1)을 제거합니다.
   14. 마이크로 원심분리기에서 반전된 튜브를 2-3초(≤2,500 x g) 동안 짧게 펄스 스핀하여 펠릿(P1)과 버퍼를 아래의 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 펠릿이 파괴되었는지 확인하기 위해 위아래로 피펫팅하여 sark-buffer에 불용성 펠릿(P1)을 재현탁합니다.
   15. 페어 밸런스 및 180,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 추가로 원심분리기.
   16. 옵션인 세척 상등액(S2)을 버리고 사르코실 불용성 펠릿(P2)을 50-75μL의 요소 완충액(표 1)에 1x PIC(프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일)와 함께 실온에서 30분 동안 배양하여 펠릿을 용해시킵니다.
       메모: SDS 침전을 피하기 위해 사용하기 전에 요소 완충액을 실온으로 가열하십시오. 세제에 민감한 응용 분야의 경우, 요소 완충액에서 SDS를 생략하고 요소 완충액에 재현탁하기 전에 불용성 펠릿(P2)을 저염 완충액에서 세척하는 것이 좋습니다.
   17. 재현탁 펠릿 (P2)을 0.5 mL 튜브로 옮기고 20 % 진폭 (최대 강도 = 40 %)에서 짧은(1 초) 마이크로팁 초음파 처리를 사용하여 펠릿을 완전히 용해시킵니다.
   18. BCA 분석법을 사용하여 사르코실 용해성(S1) 및 불용성(P2) 분획의 단백질 농도를 측정합니다. 이 분획을 즉시 사용하거나 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

표 1: 버퍼 목록

10% w/v 사르코실 용액: ddH2O 100ml당 N-lauryl-sarcosine 나트륨 염 10g(RT에서 하룻밤 동안 약동)

저염(LS) 완충액: 50mM HEPES pH 7.0, 250mM 자당, 1mM EDTA

사르코실(사크) 완충액: LS 완충액 + 1%(w/v) 사르코실 + 0.5M NaCl

요소 완충액 (-20 °C에서 보관) : 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 8M 요소, 2 % SDS

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일, EDTA 무함유(100X)	써모 피셔	78441	프로테아제 & 포스파타제 억제제 칵테일
음파 Dismembrator 시스템 (초음파 발생기)	피셔 사이언티픽	FB505110	MicroTip 초음파 발생기
Optimax TLX 초원심분리기	벡크만 쿨터	361545	냉장 초원심분리기
TLA120.1 로터	벡크만 쿨터	362224	초원심분리기 로터
500 ul (8x34mm) 폴리카보네이트 튜브, thickwall	벡크만 쿨터	343776	TLA120.1 로터용 초원심분리기 튜브
N-라우로일사르코신 나트륨 염 (사르코실)	시그마 알드리치	엘5777-50G	세정제
1.5ml 폴리 프로필렌 펠렛 유봉	킴블 체이스	749521-1500	균질화 도구
펠렛 유봉용 무선 모터	킴블 체이스	749540-0000	균질화 도구