실험적 자가면역 신경염 마우스 모델에서 운동 기능 평가

초록

출처: Gonsalvez, D. G., et al., 기능 및 신경병리학적 평가를 위한 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 신경염을 유도하는 간단한 방법. J. Vis. 특급. (2017).

이 비디오는 백일해 독소와 미엘린 모방 펩타이드 및 보조제를 함유한 접종을 통해 마우스 모델의 운동 기능 장애를 평가한 후 운동 기능을 평가하고 면역 활성화 및 탈수초화로 인한 신경 손상을 평가하기 위한 트레드밀 테스트를 수행하는 과정을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. EAN (실험적 자가면역 신경염) 유도

참고: EAN은 6-8주 사이의 수컷 C57BL/6 마우스에서 성공적으로 유도될 수 있습니다. 인덕션 프로토콜은 총 9일이 소요됩니다. 0일은 첫 번째 예방 접종일을 나타냅니다. 이 프로토콜의 경우, 주사는 마취 하에 수행되었습니다(아래 1.1.2단계 참조).

1. -1일차:
   1. 멸균 0.1M 마우스 등장성 인산염 완충 식염수(MT-PBS)를 사용하여 1.6μg/mL의 백일해 독소(재료 표 참조) 용액을 준비합니다.
   2. 이소플루란을 사용한 마취:
      1. 마우스(C57BL/6, 수컷, 6-8주)를 마취실에 넣고 산소 흐름을 1L/min으로 조정합니다.
      2. 이소플루란 기화기를 켜고, 마취를 위해 2.5%로 조정하고, 호흡을 모니터링하고, 2분 동안 또는 주요 반사(각막 및 뒷다리)가 더 이상 반응하지 않을 때까지 기다립니다.
   3. 마취실에서 마우스를 꺼내고 30_1/2G 바늘이 있는 0.5mL 주사기를 사용하여 복강내(IP) 주사를 통해 위의 백일해 독소 용액 250μL를 투여합니다.
   4. 면역 접종을 위한 주사 가능한 접종물을 준비합니다.
      1. 0.9% 식염수 중 P0180-199 펩타이드 2mg/mL 용액(> 98% 순도, 시퀀스 S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-L-D-H-S-R-S)을 사용하여 용액 A를 준비합니다.
      2. Freund의 완전 보조제(15% mannide monoolate + 85% 파라핀 오일 및 0.5mg/mL의 건조 사멸 및 건조 Mycobacterium butyricum으로 구성)에서 Mycobacterium tuberculosis의 20mg/mL 용액(재료 표 참조)을 사용하여 용액 B를 준비합니다.
      3. 주입을 위한 최종 접종물을 만들려면 용액 A와 B의 동일한 부피 부분을 비드 비터에 결합하고 실온에서 1분 동안 최대 속도로 혼합합니다.
         메모: 용액 A와 B는 재고로 보관하고 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있지만, 결합된 최종 접종물은 마우스 주입 당일에 새로 준비해야 합니다.
2. 0일차에 23G 바늘을 사용하여 피하 주사를 통해 50μL의 접종물(1.1.4단계에서 설명)을 마우스에 투여합니다.
   메모: 주사는 견갑골 사이 또는 꼬리 다리와 꼬리 사이 꼬리 등쪽 위에 놓을 수 있습니다.
3. 1일차에 1.2μg/mL(MT-PBS)의 백일해 독소 용액을 만들고 301/2G 바늘이 있는 0.5mL 주사기를 사용하여 i.p. 주입을 통해 마우스에 250μL를 투여합니다.
4. 3일차에 위의 1.3단계를 반복합니다.
   메모: 원액 A와 B는 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하고 구성할 수 있습니다. 그러나 원액 A와 B를 결합하여 생산된 최종 주사 가능한 접종물은 주사 당일에 수행해야 합니다.
5. 8일째에 1.2단계(각 동물)와 동일한 주사 부위에 피하 주사(위의 1.2단계 참조)를 통해 50μL의 접종물(1.1.4단계에서 설명)을 마우스에 투여
합니다.

2. 운동 기능 평가

참고: 운동 성능은 동일한 동물 코호트에 대한 임상 점수와 병행하여 평가됩니다. 운동 기능 평가 장치는 보행 기능 이미징 시스템(자료 표 참조)이 설치된 컴퓨터에 연결해야 합니다. 또한 평가할 모든 마우스는 EAN 유도 전에 실행 작업에 익숙화하는 것이 좋습니다. 이를 위해 질병 유발 3일 전(-3일차) 연습 실행(마우스당 2회 테스트 실행)을 수행합니다.

1. 모터 기능 평가 장치를 켜고 조명 버튼을 켭니다.
2. 쥐의 꼬리를 잡고 빨간 잉크가 채워진 용기 위에 쥐를 내려 단단히 긁고 발에 잉크를 묻힙니다.
   메모: 이 단계는 C57BL/6 균주에 필요하지만 흰색 코트 색상의 마우스 균주를 사용하는 경우 건너뛸 수 있습니다.
3. 마우스를 보행실에 넣고 트레드밀 속도를 15cm/s로 설정합니다.
4. 트레드밀을 켜고 "기록" 버튼을 클릭하여 보행 기능 이미징 시스템을 사용하여 마우스의 달리기 동작을 캡처합니다(재료 표 참조).
5. 타이머를 사용하여 36초 동안 각 달리기를 측정합니다. 36초 후 녹음을 중지하고 트레드밀을 중지합니다.
   메모: 이 36초 간격 동안 실행 중인 작업을 성공적으로 완료할 수 없는 마우스는 실패한 것으로 간주됩니다.
6. 지정된 폴더에 비디오 파일을 저장합니다.
7. 평가할 각 마우스에 대해 위의 단계를 반복합니다. 3일마다 동일한 실행 작업으로 마우스를 테스트합니다.
8. 보행 기능 매개변수에 대한 소프트웨어를 사용하여 편집된 비디오 파일을 분석합니다(재료 표 참조).
   메모: 다른 모터 매개변수를 분석하는 방법에 대한 자세한 내용은 소프트웨어마다 다르므로 분석하기 전에 제조업체의 지침을 참조하십시오. 연구의 구체적인 목적에 따라 운동 후 기능 평가의 모든 단계에서 동물 조직을 채취하여 면역조직화학 또는 전자 현미경을 통해 축삭 및 수초 손상의 조직학적 증거를 얻을 수 있습니다.

결과

표 1: EAN 임상 점수 패러다임.

개

점수	기준	평가 기준에 대한 참고 및 의견
0	일반 마우스
1	덜 활기차거나 선반	이는 정상적인 취급에 대한 응답으로 평가되며, 마우스는 일반적으로 면역 접종 후 5일째부터 활동 감소 징후를 처음 보입니다
2...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6, 수컷, 6-8주	Australian Bioresources Cenre, WA, 호주
백일해 독소	목록 생물학 연구소, Inc., 캘리포니아, 미국	#181
0.1M 마우스 등장성 인산염 완충 식염수(MT-PBS)			실험실에는 자체 프로토콜이 있습니다.
이소플루란	Pharmachem, QLD, 오스트레일리아		실험실은 관리를 위한 자체 프로토콜을 가지고 있습니다.
P0180–199 펩타이드	우시 노디스크 생명공학 Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, 시퀀스 S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
열로 인한 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) (H37RA 균주)	Difco, 미시건, 미국	#231141
프로인드의 컴플리트 보조제(FCA)	Difco, 미시건, 미국	#263910
16% 파라포름알데히드(PFA)	전자 현미경 서비스	#의 15710	조직 채취 일을 4% PFA로 희석합니다.
글루타랄드헤이드 25%	ProSciTech Pty Ltd, QLD, 호주	#11-30-8	고정 일 2.5 % 글루 타르 알데히드로 희석합니다.
아지드화나트륨	Chem-Supply Pty Ltd, SA, 호주	재질 보기 SL189	0.1M MT-PBS에 10%(w/v) 재고를 생성합니다. 0.03%(v/v)에서 사용합니다.
자당	Chem-Supply Pty Ltd, SA, 호주	SA030	30%(w/v)에서 사용합니다.
최적 절단 온도(OCT) 매체	Sakura Finetek, 캘리포니아, 미국	#의 4583
일반 당나귀 세럼	Merck Millipore, 미국 매사추세츠주	#S30-100	10%(v/v) 또는 자체 실험실에서 결정한 기타 농도의 항체 희석제로 사용합니다.
트리톤-X 100	시그마 알드리치, 미시건, 미국	#90o2-31-1	0.3%(v/v) 또는 자체 실험실에서 결정한 기타 농도의 항체 희석제에 사용합니다.
토끼 항아밀로이드 전구체 단백질(APP)	Invitrogen (Life Technologies), 미국 캘리포니아	S12700	1:400 또는 자체 실험실에서 적정에 사용됩니다.
토끼 anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	이스라엘 Wiezmann Institute of Science의 Elior Peles 교수가 준 선물		1:500 또는 자체 실험실에서 적정에 사용됩니다.
적절한 Alexa Fluor 접합 2차 항체	Molecular Probes (Life Technologies), 오리건, 미국	다양한	1:200에 사용하거나 자체 실험실에서 적정합니다. 항체가 형성된 종과 Alexa Fluor의 선택은 각 실험실의 재량에 따라 결정됩니다.
수성 장착 솔루션	Dako(Agilent), 미국 캘리포니아주	#S3023	각 실험실은 고유한 선호도가 있습니다.
설비
0.5mL 주사기(301/2g 바늘 포함)	BD (영어)	#326105
바늘 23g	BD (영어)	#305143
빨간 잉크 패드			빨간 잉크 패드나 빨간 식용 염료를 사용하여 동물의 발을 표시할 수 있습니다.
DigiGate 장치(트레드밀 포함)	eMouse Specifics Inc. 프레이밍햄, 매사추세츠
DigiGate 이미징 시스템	eMouse Specifics Inc. 프레이밍햄, 매사추세츠
스톱 워치			모든 타이머를 사용할 수 있습니다.
DigiGait 8 소프트웨어	eMouse Specifics Inc. 프레이밍햄, 매사추세츠
해부 현미경	자이스		적절한 해부 현미경을 사용할 수 있습니다.
충전된 슬라이드	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd (주	SF41296SP
시로스타트	라이카		적절한 사이클리스트를 사용할 수 있습니다.
관류 장비 및 해부 기구			실험실에는 자체 관류 프로토톡톨이 있습니다.
불투명 한 humified 챔버			실험실은 불투명한 플라스틱 용기를 사용하여 자체 생산할 수 있습니다.
PAP 펜네	GeneTex(미국)		왁스 연필 또는 표면 장력을 사용하여 조직 섹션 주위에 우물을 만들 수도 있습니다.
컨포칼 현미경	자이스 LSM780		적절한 레이저 라인이 있는 모든 컨포칼 현미경을 사용할 수 있습니다.
피지/이미지 J	국가 보건 연구소		www.fiji.sc 부터 사용 가능

)