Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

초록

출처: Donnelly, K. M., et al. Drosophila melanogaster에서 프리온 유사 단백질 응집체의 세포 간 전송 모니터링. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

프로토콜

1. Coupling Gal4- 및 QF-mediated Htt Transgene Expression in Drosophila (초파리에서 Gal4- 및 QF 매개 Htt 전이유전자 발현 결합

)

1. Gal4-UAS 또는 QF-QUAS의 다운스트림에서 야생형 또는 돌연변이 Htt 전이유전자를 포함하는 라인뿐만 아니라 조직 특이적 Gal4 또는 QF "드라이버"를 포함하는 형질전환 Drosophila melanogaster 라인을 수집 및/또는 생성합니다. 이러한 전이유전자에서 발현되는 단백질이 형광 단백질에 융합되거나 에피토프 태그가 지정되어 동일한 플라이에서 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자 산물을 구별할 수 있도록 합니다. 그림 1.
   참조 참고: 우리는 일반적으로 인간 Htt 유전자의 엑손 1 단편을 사용합니다. 그러나, 원하는 경우 더 긴 Htt 단편 또는 다른 유전자를 발현하기 위해 형질전환 파리를 대신 생성할 수 있습니다.
2. 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자가 서로 겹치지 않는 별개의 세포 집단에서 발현되도록 유전 전략을 계획합니다.
   1. 발현 중복이 발생하면 동일한 세포에서 합성된 돌연변이 및 야생형 Htt 단백질이 공동 응집되어 프리온과 유사한 이벤트의 검출을 방지합니다. 이를 방지하려면 Gal4 및 QF 특정 억제자인 Gal80 및 QS40을 각각 사용하십시오(그림 1). 발달 제어 Gal4 및/또는 QF 드라이버를 선택하면 돌연변이 Htt의 발현을 유사분열 후 세포로 제한하는 데 도움이 될 수 있으며, 세포 분열이 세포 간 응집체 확산에 기여할 수 있는 가능성을 제거할 수 있습니다.
3. 표준 배양 조건을 사용하여 파리를 짝짓기하여 "공여자" 세포 집단에서 QF(또는 Gal4)를 통해 돌연변이 Htt를 발현하고 "수용자" 세포 집단에서 Gal4(또는 QF)를 통해 야생형 Htt를 발현하는 자손을 생성합니다. 가능한 유전자 조합을 보여주는 개략도는 그림 1을 참조하십시오.
   메모: 그림 1-4 및 이전 간행물에 표시된 데이터를 생성하는 데 사용된 QF 및 Gal4 드라이버에는 DA1 후각 수용체 뉴런(ORN) 드라이버인 Or67d-QF와 범아교성 드라이버인 repo-Gal4가 포함됩니다.
4. QF 및 Gal4 표지 세포 집단 모두에서 야생형 Htt를 발현하는 대조 파리를 병렬로 생성합니다.
5. 원하는 유전자형의 자손을 수집하고 적절하게 동물의 나이를 먹습니다.

2. 성인 초파리 뇌의 미세 해부 및 고정

참고: 이 해부 절차는 이전 간행물에서 수정되었으며 Htt-형광 단백질 융합체에서 직접 형광 신호를 이미징하기 위해 뇌를 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 다음 물질을 모아 얼음 위에 놓습니다: 0.03% Triton X-100 (PBS/T)을 함유한 인산염 완충 식염수; 770 μL PBS/T에 200 μL 20% PFA를 첨가하여 제조한 970 μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 고정 용액을 함유한 마이크로 원심분리 튜브; 웰이 들어있는 투명 유리 접시; 일회용 전사 피펫; 두 개의 해부 겸자(3번 1개 및 5번 1개).
2. CO₂를 사용하여 성충 파리를 마취하고 얼음 위의 유리 접시 한 우물로 옮깁니다.
3. 이송 피펫을 사용하여 파리가 있는 웰과 빈 웰에 소량(~ 500μL)의 차가운 PBS/T를 추가합니다. 너무 많은 거품은 해부를 방해할 수 있으므로 너무 많이 도입하지 마십시오.
4. 유리 접시를 해부 현미경 아래의 평평한 표면에 놓고 파리체가 시야를 채우고 초점이 맞춰질 때까지 배율을 조정합니다.
5. 빛이 유리 접시의 양쪽을 비추도록 한 쌍의 구즈넥 광원을 배치합니다. 접힌 실험실 조직을 유리 접시 아래에 고정하여 해부 중에 신체 부위/큐티클을 버립니다.
6. 주로 사용하지 않는 손에 있는 3번 집게를 사용하여 PBS/T가 들어 있는 우물로 파리 한 마리를 옮깁니다. 복부 쪽이 위를 향하도록 복부를 잡아 파리를 움직이지 못하게 합니다.
7. 플라이를 PBS/T에 완전히 담근 상태에서 주로 사용하는 손에 5번 집게로 플라이 헤드를 제거합니다. 이 집게의 한 끝을 플라이 헤드의 한쪽에 있는 주둥이에 인접한 작은 공간의 큐티클 아래에 삽입합니다. 집게를 꼬집어 양쪽에서 눈을 잡아 머리를
잡습니다.
8. 두 집게를 분리하여 몸통에서 플라이 헤드를 제거합니다. 파리 시체를 근처에 있는 실험실 티슈에 버리십시오. 플라이 헤드가 손실되지 않도록 주로 사용하는 손 집게에 대한 압력을 유지하십시오.
9. 주로 사용하지 않는 손에 있는 3번 겸자의 한 쪽 끝을 반대쪽의 큐티클 아래 같은 작은 공간에 놓습니다. 위치를 잡으면 집게를 집어 머리 양쪽의 같은 위치에 있는 눈을 잡습니다.
10. 큐티클의 그립이 고정되면 집게를 180°로 부드럽게 당겨 벌립니다. 이 작용은 뇌를 손상시키지 않고 머리 표피를 분해할 것입니다. 큐티클 잔여물을 실험실 조직에 버리십시오.
    1. 이상적이기는 하지만 머리 큐티클이 한 번에 완전히 제거되지 않을 수 있습니다. 이 경우 뇌가 완전히 노출될 때까지 큐티클을 하나씩 제거한다. 겸자에 직접 닿지 않도록 하여 뇌를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
11. 부착된 기관을 잡거나 모세혈관 작용으로 겸자 끝 사이의 공간으로 뇌를 흡인하여 PBS/T에서 절개된 뇌를 제거합니다.
    메모: 기관 제거는 선택 사항인데, 이는 우리가 일반적으로 영상화하는 뇌의 앞쪽 표면에 있는 더듬이 엽을 가리지 않는 경향이 있기 때문입니다. 그러나 기관이 이미징을 방해하는 경우 이 조작으로 인해 뇌가 손상되지 않도록 조심스럽게 제거하십시오.
12. 파리 뇌를 얼음 위의 고정 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브 중 하나로 옮깁니다. 뇌가 겸자에서 분리되어 고정 용액에 잠겨 있는지 확인합니다.
13. 모든 뇌를 해부한 후, 닫힌 튜브를 너트레이터에 놓고 어두운 곳에서 실온에서 ~5분 동안 "단축 수정"을 합니다.
    알림: 이 짧은 고정 단계는 후속 단계에서 뇌를 더 쉽게 처리할 수 있도록 하고 미세 원심분리기 튜브의 측면에 달라붙지 않도록 합니다.
14. P1000 피펫으로 대부분의 고정용액을 제거하고 폐기합니다.
    1. 이 단계와 이후의 세척 단계에서 튜브에서 뇌를 흡인하지 마십시오. P1000을 더 낮은 부피(예: 650μL)로 설정하고 두 단계로 상층액을 제거합니다. 또한 마이크로 원심분리기 튜브를 광원(예: 오버헤드 조명)과 일직선으로 유지하면서 뇌를 더 잘 시각화하기 위해 흡인합니다.
15. 신선한 PBS/T 1mL를 뇌에 첨가합니다. 어둠 속에서 빠르게(< 1분) 씻고 뇌에서 상층액을 흡인하고 버리십시오.
16. 다음 일정에 따라 실온의 어두운 곳에서 PBS/T로 세탁을 반복합니다: 2회(< 1분) 세탁, 1 X 5분, 3 X 20분 및 1 X 1시간 세탁. 마이크로 원심분리기 튜브의 상단을 고정하고 세척 사이에 너트기에 튜브를 놓습니다.
    1. DAPI 염색이 필요한 경우, 최종 1시간 세척을 PBS/T로 희석된 250ng/mL DAPI로 1 X 30분 배양으로 교체한 다음 2X 급속 세척 및 1X 20분 세척으로 교체합니다.
17. 마지막 세척 후 뇌를 방해하지 않도록 주의하면서 세척 완충액 상층액의 대부분을 제거하고 글리세롤 기반 퇴색 방지 시약 30μL를 뇌에 첨가합니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 최소 1 시간에서 최대 24 시간 동안 움직이지 않고 배양하십시오.

3. 전뇌 장착

1. 유리 현미경 슬라이드를 해부 현미경 아래에 놓고 식별 정보를 적어 표시합니다.
   참고: 또는 뇌를 커버 유리에 직접 장착하여 이미징하는 동안 뇌의 양쪽에 접근할 수 있습니다. 이 장착 절차를 설명하는 프로토콜은 이전에 발표되었습니다 45.
2. 뭉툭한 피펫 팁(면도날을 사용하여 1-1μL 팁에서 바닥 ~ 200cm를 제거)을 사용하여 각 미세 원심분리기 튜브에서 뇌를 제거하고 슬라이드 중앙으로 옮깁니다. 퇴색 방지 시약을 가능한 한 적게 뇌로 옮깁니다.
3. 집게를 사용하여 뇌를 원하는 방향으로 배치합니다(예: 등쪽은 슬라이드 위쪽을 가리키고 앞쪽 표면은 더듬이 엽을 이미징하기 위해 위를 향함). 뇌의 방향을 지정할 때 뇌를 이미징하는 데 사용할 현미경의 광 경로를 고려하십시오.
4. 뇌를 방해하지 않고 접힌 실험실 조직의 뾰족한 모서리를 사용하여 슬라이드에서 과도한 퇴색 방지 시약을 제거합니다. 뇌가 슬라이드에 부착할 수 있도록 어둠 속에서 슬라이드를 ~ 5-10분 동안 그대로 두십시오.
5. 뇌의 양쪽에 놓인 4개의 깨진 커버 유리 조각으로 파리 뇌를 둘러싸서 ~ 19mm x 19mm의 정사각형을 형성합니다. 이 작은 유리 조각 중 하나 바로 바깥에 22mm x 22mm No. 1.5 커버 유리의 한쪽 가장자리를 놓고 뇌 위로 커버슬립을 부드럽게 내려 브리지 마운트를 완성합니다.
6. 커버슬립 아래의 표면을 채우기 위해 새로운 퇴색 방지 시약을 천천히 분배하고 커버슬립이나 뇌를 방해하지 않도록 주의하십시오. 커버슬립에 직접 닿지 않도록 접힌 실험실 티슈의 뾰족한 모서리를 사용하여 과도한 퇴색 방지제를 닦아냅니다.
7. 커버슬립의 네 모서리 각각에 투명하고 속건성 매니큐어 한 방울을 떨어뜨립니다. ~ 10 분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 커버슬립의 네 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 뇌를 완전히 둘러쌉니다.
8. 뇌를 즉시 이미지화하거나 준비될 때까지 4°C에서 보관하십시오.
   1. Htt-형광 단백질 융합체에서 고유 형광을 이미징하는 경우 최상의 신호를 위해 24시간 이내에 뇌를 이미징합니다.

4. 응집체의 프리온과 같은 전달의 이미징 및 정량화

1. 40X 또는 60/63X 오일 대물렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용하여 장착된 뇌를 이미지화하여 선택한 Gal4 및 QF 드라이버가 발현되는 뇌 영역을 통해 z-슬라이스 이미지를 수집합니다(그림 2A, B).
   1. 적절한 레이저(예: GFP/YFP/FITC의 경우 488nm, mCherry/Cy3의 경우 552nm)를 사용하여 형광 단백질 융합 또는 면역 표지 단백질을 여기시킵니다. 스펙트럼 감지 시스템 또는 각 형광단에 특정한 대역/장거리 통과 방출 필터를 사용하여 채널 누화를 제거하면서 최대 형광 신호를 캡처하는 감지 창을 설정합니다.
      참고: 단백질 응집체를 이미징할 때 주의하십시오. 각 집계의 중앙에 있는 픽셀은 특히 더 큰 집계에서 포화 상태가 되기 쉽습니다. 이미지의 채도를 최소화하려고 시도하되 더 작은 응집된 종에서 신호를 잃을 위험에 유의해야 합니다(그림 2B, C, D). 채도가 너무 높으면 이미지 배경이 증가하여 분리된 반점을 식별하기가 더 어려워집니다. 각 데이터 세트에서 최종 이미지를 촬영하기 전에 다양한 이미징 설정을 테스트하여 최적화합니다.
2. 개별 z 슬라이스(예: 그림 2C 및 그림 4A)를 통해 수동으로 이동하거나 컨포칼 슬라이스를 3차원(그림 3A, B)으로 렌더링한 후(그림 3A, B) 개별 반점을 정량화하여 데이터를 분석합니다.
   메모: 이 작업은 Image J 또는 기타 이미지 처리 소프트웨어에서 수행할 수 있습니다.
   1. 응집체가 잘 분리되어 있고 배경 형광이 최소인 경우 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 컨포칼 스택의 3D 재구성에서 응집체를 별개의 "물체" 또는 "표면"으로 체계적으로 식별, 정량화 및 분석합니다(그림 3B).
      메모: 설명된 소프트웨어 작업은 여기에 사용된 기기 및 소프트웨어에 따라 다릅니다(재료 표 참조).
      1. 컨포칼 z-시리즈를 3D 보기 모드로 시각화할 수 있습니다. "분석" 마법사를 사용하여 선택한 채널의 개별 스폿을 식별합니다(예: 그림 3의 HttQ91-mCherry 응집체에 대한 빨간색 채널). 임계값 및 필터를 조정하여 이질적인 크기의 모든 집계를 이미지의 개별 개체로 정확하게 표현합니다.
      2. "Binary Processing Pre-Filter"에서 "Split objects"를 활성화하여 소프트웨어 알고리즘에 의해 비정상적으로 병합된 밀접하게 연결된 집계를 분리합니다. 개체의 총 수와 관련 측정값은 "Measurements"
         아래에 보고됩니다. 메모: 돌연변이 Htt 응집체를 정량화하는 이 방법은 아밀로이드 응집체의 중심이 항체를 통과할 수 없기 때문에 면역염색 프로토콜에 적합하지 않습니다. 그 결과, 응집체는 현미경에서 고리 모양의 구조로 나타나며 이미지 분석 소프트웨어는 이러한 개별 "반점"을 정확하게 식별하고 구별할 수 없습니다.
   2. z-stack을 수동으로 이동하고 야생형 Htt 집계를 스코어링하여 와일드 유형 Htt 집계를 정량화하여 둘 이상의 슬라이스에 나타나는 집계가 이중 점수가 매겨지지 않도록 합니다(그림 4A).
      메모: 이 수동 정량화 접근 방식은 각 공초점 스택의 응집체 수가 합리적일 때(예: 20-50) 사용할 수 있습니다. 또한 이미지 분석 소프트웨어가 동일한 채널의 주변 신호와 개별 반점을 구별할 수 없는 경우(예: 인근 세포의 확산 야생형 Htt의 신호)에도 유용합니다(그림 2B, C 및 그림 4A). 야생형 Htt 응집체를 정량화하는 것도 어려울 수 있는데, 이는 뇌의 많은 정상 구조가 반점으로 보이기 때문입니다(예: 세포 돌기 및 시냅스). 야생형 및 돌연변이 Htt 신호의 공동 국소화(co-localization)를 선택 기준으로 사용할 수 있습니다. 그러나 일부 돌연변이 Htt "씨앗"이 공막의 검출 한계 이하로 떨어질 수 있습니다. 수용 세포에 응집되지 않는 Htt 이외의 단백질(예: GFP)은 뇌의 관련 없는 반점 구조를 표지하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 개별 응집체의 추가 특성화를 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 응집체의 크기 분포(그림 3C), 돌연변이체와 야생형 Htt 단백질 간의 공동 국소화 비율(그림 4A)을 결정하거나 FRET를 사용하여 단백질-단백질 상호 작용을 직접 측정합니다(그림 4B).
   1. 특정 채널에서 보이는 모든 응집체를 정확하게 식별하는 스폿 또는 표면 감지 알고리즘을 사용하여 개별 반점의 크기 분포를 결정합니다. 예를 들어 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 스폿 또는 표면의 관련 측정을 수행합니다(예: 4.2.1.
      단계에 설명된 소프트웨어 "분석" 마법사의 "측정'에서 '골재 직경'(그림 3C), '부피' 또는 '강도' 정보 얻기). 메모: 그림 3C에서는 단일 DA1 사구체에서 확인된 모든 HttQ91-mCherry 반점에 대한 직경 분포를 보고합니다.
   2. 컨포칼 z-스택을 통해 슬라이스별로 수동으로 이동하여 HttQ25-YFP와 HttQ91-mCherry 응집체 간의 공동 국소화 비율을 결정합니다(가장 정확한 방법). 그러나 집계를 두 번 계산하지 않도록 주의하십시오. 이를 방지하려면 초점면이 집합체의 중심을 통과하는 경우 특정 z-slice의 집계만 계산합니다(그림 4A).
   3. 수용체 광표백 방법을 사용하여 공동국소화된 HttQ91-mCherry 신호로 유도된 HttQ25-YFP 응집체에 대한 FRET 효율을 계산합니다.
      1. 먼저, 다른 채널에서 신호를 생성하지 않는 mCherry 전용 및 YFP 전용 신호에 대한 감지 창을 설정하여 YFP와 mCherry 채널 간의 잠재적인 혼선을 제거합니다. 이러한 설정을 사용하여 개별 HttQ25-YFP 반점 및 관련 HttQ91-mCherry 신호의 '이전 이미지'를 가져옵니다( 그림 4B).
      2. 그런 다음 적색 레이저(예: 552nm)를 100% 강도로 조정하여 mCherry 신호를 광표백하고 신호가 사라질 때까지 스캔합니다. '이전 이미지'에 사용된 설정으로 되돌리고 동일한 반점의 '이후 이미지'를 가져옵니다(그림 4B).
      3. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 광표백 전후의 각 푼크텀에 대한 형광 강도 측정값을 계산합니다.
      4. 'before image'(YFPinitial)에서 측정된 YFP donor fluorescence와 'after image'(YFPfinal)의 YFP donor fluorescence를 빼서 FRET 효율을 계산합니다. 이 값을 YFPfinal로 나누고 100.
         을 곱합니다. 메모: FRET 효율은 각 HttQ25-YFP 응집체에 대해 픽셀 단위 또는 전체적으로 계산할 수 있습니다(그림 4B). 수용체 광표백은 각 HttQ25-YFP 퐁텀과 관련된 mCherry 신호가 mCherry 광표백 후 검출 가능한 YFP 퀄칭을 생성할 수 있을 만큼 충분히 높을 때 FRET 효율을 계산하는 데 특히 유용한 기술입니다.

결과

그림 1. QF-QUAS 및 Gal4-UAS 이진 발현 시스템을 사용하여 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자의 결합 발현을 위한 유전적 접근 방식. "세포 A"에서, 병원성 길이의 polyQ 스트레치(Q91)를 포함하는 mCherry-tagged 돌연변이 Htt 단백질은 조직 특이적 프로모터 A("PA")의 다운스트림에 위치한 QF 드라이버를 사용하여 발현됩니다. "세포 B"에서, 정상 polyQ 스트레치(Q25)를 포함하는 YFP-태그 야생형 Htt는 조직 특이적 프로모터 B("PB")에 의해 제어되는 Gal4 드라이버를 통해 발현됩니다. 그림 2-4에서 Or67d-QF는 DA1 ORN에서 QUAS-HttQ91-mCherry 발현을 구동하는 데 사용되었고, repo-Gal4는 모든 glia27에서 UAS-HttQ25...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수(PBS), 10X, pH 7.4	써모피셔 사이언티픽	AM9625	1X로 희석
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T9284-1L
킴와이프	토마스 사이언티픽	2904F24 (영문
파라포름알데히드(PFA) 20%	전자 현미경 과학	15713-에스
일반 염소 혈청(NGS), 여과됨	Lampire 생물학 연구소	7332500	수령 시 부분 표본 및 동결
닭고기 안티 GFP	아베스 랩스	GFP-1020	1:500 희석에서 사용
토끼 안티 DsRed	클론텍	632496	1:2000 희석에서 사용, DsRed 기반 형광 단백질(예: mCherry, mStrawberry, tdTomato 등)을 인식할 수 있습니다.
마우스 안티 브루흐파일럿	발달 연구 Hybridoma Bank	NC82	1:100 희석에서 사용; 파리 뇌 전체에 걸쳐 활성 시냅스 전 구조를 표시합니다
FITC 안티 치킨	써모피셔 사이언티픽	SA1-7200	1:250 희석에서 사용
Alexa Fluor 568 토끼 방지	생명 기술	A11011	1:250 희석에서 사용
Alexa Fluor 647 안티 마우스 항체	생명 기술	A21235	1:250 희석에서 사용
Slowfade Gold Antifade 시약	생명 기술	S36936
현미경 슬라이드(25 x 75 x 1.0mm)	피셔 사이언티픽	전화: 12-550-143
커버 유리(22 x 22mm)	글로브 사이언티픽	1404-15
Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 3	테드 펠라	503	주로 사용하지 않는 핸드에 사용
Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 5	테드 펠라	505	주로 사용하는 핸드에서 사용
LAS X 이미지 분석 소프트웨어	라이카
Imaris 이미지 분석 소프트웨어	비트플레인

) 시리즈 . 년 의 의