Imaging and Quantification of Protein Aggregates in Genetically Modified Drosophila Brains (유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화)

Abstract

출처: Donnelly, K. M., et al. Drosophila melanogaster에서 프리온 유사 단백질 응집체의 세포 간 전송 모니터링. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 유전자 변형 초파리 뇌에서 단백질 응집체의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. 뇌는 장착하기 전에 고정, 세척 및 페이딩 방지제로 처리됩니다. 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 캡처하고 정량화하여 돌연변이 단백질 응집체의 전달을 관찰합니다.

Protocol

1. Coupling Gal4- 및 QF-mediated Htt Transgene Expression in Drosophila (초파리에서 Gal4- 및 QF 매개 Htt 전이유전자 발현 결합

)

1. Gal4-UAS 또는 QF-QUAS의 다운스트림에서 야생형 또는 돌연변이 Htt 전이유전자를 포함하는 라인뿐만 아니라 조직 특이적 Gal4 또는 QF "드라이버"를 포함하는 형질전환 Drosophila melanogaster 라인을 수집 및/또는 생성합니다. 이러한 전이유전자에서 발현되는 단백질이 형광 단백질에 융합되거나 에피토프 태그가 지정되어 동일한 플라이에서 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자 산물을 구별할 수 있도록 합니다. 그림 1.
   참조 참고: 우리는 일반적으로 인간 Htt 유전자의 엑손 1 단편을 사용합니다. 그러나, 원하는 경우 더 긴 Htt 단편 또는 다른 유전자를 발현하기 위해 형질전환 파리를 대신 생성할 수 있습니다.
2. 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자가 서로 겹치지 않는 별개의 세포 집단에서 발현되도록 유전 전략을 계획합니다.
   1. 발현 중복이 발생하면 동일한 세포에서 합성된 돌연변이 및 야생형 Htt 단백질이 공동 응집되어 프리온과 유사한 이벤트의....

Results

그림 1. QF-QUAS 및 Gal4-UAS 이진 발현 시스템을 사용하여 돌연변이 및 야생형 Htt 전이유전자의 결합 발현을 위한 유전적 접근 방식. "세포 A"에서, 병원성 길이의 polyQ 스트레치(Q91)를 포함하는 mCherry-tagged 돌연변이 Htt 단백질은 조직 특이적 프로모터 A("PA")의 다운스트림에 위치한 QF 드라이버를 사용하여 발현됩니다. "세포 B"에서, 정상 polyQ 스트레치(Q25)를 포함하는 YFP-태그 야생형 Htt는 조직 특이적 프로모터 B("PB")에 의해 제어되는 Gal4 드라이버를 통해 발현됩니다. 그림 2-4에서 Or67d-QF는 DA1 ORN에서 QUAS-HttQ91-mCherry 발현을 구동하는 데 사용되었고, repo-Gal4는 모든 glia27에서 UAS-HttQ25.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인산염 완충 식염수(PBS), 10X, pH 7.4	써모피셔 사이언티픽	AM9625	1X로 희석
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T9284-1L
킴와이프	토마스 사이언티픽	2904F24 (영문
파라포름알데히드(PFA) 20%	전자 현미경 과학	15713-에스
일반 염소 혈청(NGS), 여과됨	Lampire 생물학 연구소	7332500	수령 시 부분 표본 및 동결
닭고기 안티 GFP	아베스 랩스	GFP-1020	1:500 희석에서 사용
토끼 안티 DsRed	클론텍	632496	1:2000 희석에서 사용, DsRed 기반 형광 단백질(예: mCherry, mStrawberry, tdTomato 등)을 인식할 수 있습니다.
마우스 안티 브루흐파일럿	발달 연구 Hybridoma Bank	NC82	1:100 희석에서 사용; 파리 뇌 전체에 걸쳐 활성 시냅스 전 구조를 표시합니다
FITC 안티 치킨	써모피셔 사이언티픽	SA1-7200	1:250 희석에서 사용
Alexa Fluor 568 토끼 방지	생명 기술	A11011	1:250 희석에서 사용
Alexa Fluor 647 안티 마우스 항체	생명 기술	A21235	1:250 희석에서 사용
Slowfade Gold Antifade 시약	생명 기술	S36936
현미경 슬라이드(25 x 75 x 1.0mm)	피셔 사이언티픽	전화: 12-550-143
커버 유리(22 x 22mm)	글로브 사이언티픽	1404-15
Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 3	테드 펠라	503	주로 사용하지 않는 핸드에 사용
Dumont 생물학 등급 겸자, 스타일 5	테드 펠라	505	주로 사용하는 핸드에서 사용
LAS X 이미지 분석 소프트웨어	라이카
Imaris 이미지 분석 소프트웨어	비트플레인