반응성 성상교세포증을 유도하기 위해 마우스 모델에서 피질 찌르기 손상 발생

초록

출처: Allahyari, R. V. et al. 전뇌 찌르기 손상에 의한 생체 내 반응성 신경교증 유발. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 두개골 노출 및 뇌 병변 생성과 관련된 쥐의 피질 찌르기 손상 절차를 보여줍니다. 성상세포의 신경 보호 반응인 반응성 성상아교세포증을 유도하여 CNS 외상, 염증 및 복구 메커니즘을 연구합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술을 위한 마우스 준비

1. 가정용 케이지에서 마우스를 제거하고 무게(g)를 잰다.
2. 마우스를 이소플루란 유도 챔버에 넣고 산소를 2L/분으로, 이소플루란 기화기를 5로 설정하여 약 3-5분 동안 마취 수술면을 유도합니다. 느린 호흡과 고정을 모니터링합니다. 발가락 핀치 반사를 사용하여 마우스가 완전히 진정되었는지 확인하십시오.
3. 마우스가 완전히 진정되면 입체 프레임에 놓고 이소플루란에 튜브로 부착된 노즈 콘에 코를 고정합니다. 이어바를 외이도에 삽입하고 조여 머리가 안정되도록 합니다.
4. 머리를 귀에서 귀로, 눈 사이에서 귀 뒤까지 면도합니다.
5. 이소프로필 알코올과 베타딘 요오드 용액을 각각 3회씩 번갈아 가며 닦아 피부를 살균합니다.
6. 수술 중 양쪽 눈이 건조해지지 않도록 양쪽 눈에 인공 눈물을 바르십시오.

2. 외과 수술 절차

1. 발가락이나 꼬리를 꼬집어 마취 깊이를 모니터링합니다. 마우스는 반응이 없을 때 적절한 수술 평면에 있고 호흡이 느리고 균일합니다.
2. 눈 바로 뒤에서 거의 귀 사이까지 시상면 피부를 11번 메스 날을 사용하여 한 번의 단단한 동작으로 시상면 피부를 절개합니다. 피부를 옆으로 옮기고 지혈제로 오른쪽을 자릅니다.
3. No. 11 메스의 둔한 면과 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 위에 있는 멤브레인의 두개골을 제거합니다. 선택적으로, 0.9% 식염수에 적신 솜 끝이 있는 어플리케이터로 두개골을 닦습니다. 완전히 말리십시오.
4. 작은 자를 사용하여 관상 봉합사 꼬리 1mm에 있는 개두술의 앞쪽 경계와 시상 봉합사 옆 1mm에 있는 개두술의 왼쪽 가장자리를 영구 마커로 표시합니다(그림 1). 그런 다음 시상 봉합사와 관상 봉합사에서 각각 4mm 떨어진 곳에 개두술의 오른쪽과 꼬리 경계를 표시합니다(그림 1).
5. 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 영구 마커 윤곽을 따라 천천히 드릴링하여 개두술을 시작합니다. 두개골이 완전히 뚫리지 않도록 주의한다. 5번 집게로 고립된 두정골 조각을 부드럽게 누르면 약한 부분이 압력에 자리를 내줍니다. 얇아진 뼈가 둘레 전체에 걸쳐 충분히 약해지면 뼈 조각을 제거할 준비가 된 것입니다.
   메모: 조사자가 한 조각의 뼈를 제거하는 데 어려움을 겪는다면 이는 드릴링 중에 뼈가 충분히 얇아지지 않았음을 시사합니다. 뼈 조각을 쉽게 제거할 수 있도록 후속 동물에서 두개골을 더 뚫는 것을 고려하십시오.
6. 23G 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 소량의 0.9% 식염수를 바르고 분리된 뼈와 천공 부위를 적십니다.
7. 매니퓰레이터 암을 입체 장비에 부착합니다. 새 No. 11 메스 날을 날의 날카로운 면이 옆을 향하도록 프로브 홀더에 부착합니다.
   메모: 꼬리 조직과 꼬리 조직이 각각 칼날의 날카롭고 뭉툭한 모서리를 경험하지만, 관통 손상으로 인한 기계적 손상은 병변의 범위 전반에 걸쳐 비슷합니다. 우리는 꼬리 부분과 꼬리 부분 사이에서 GFAP 발현 또는 증식의 상향 조절을 포함하여 반응성 신경교세포의 주요 특징에서 눈에 띄는 차이를 관찰하지 못했습니다.
8. 매니퓰레이터 암이 방해가 되지 않도록 하고 5/45 각도의 집게를 사용하여 고립된 뼈를 조심스럽게 들어 올립니다. 집게의 끝을 고립된 뼈의 측면에 삽입하고 지렛대를 사용하여 한 번의 완전한 움직임으로 남겨진 뼈 조각을 들어 올립니다.
   메모: 뇌를 찌르거나 두개골 아래의 경막을 건드리지 않도록 주의한다.
9. 물에 적신 흡수성 젤 폼의 작은 조각을 가져다가 덮이지 않은 뇌에 올려 놓고 뇌가 건조해지는 것을 방지하고 존재할 수 있는 모든 혈액을 흡수합니다.
10. 젤 폼이 제자리에 놓이면 매니퓰레이터 암을 제자리로 돌리고 칼날을 젤 폼 위의 개두술 중앙에 조정합니다. 젤 폼을 제거하고 경막에 구멍을 뚫지 않고 팁이 경막에 닿을 때까지 칼날을 내립니다. 입체축의 수직 팔에 있는 버니어 스케일을 사용하여 등쪽/복부 좌표를 표시합니다.
11. 매니퓰레이터의 팔을 사용하여 블레이드를 뇌 속으로 정확히 3mm 천천히 내립니다. 이것은 매니퓰레이터 암의 버니어 스케일 표시를 사용하여 달성됩니다. 블레이드를 5-10초 동안 제자리에 두십시오. 칼날이 부착된 입위 팔을 꼬리로 세 번 움직여 칼날이 반대쪽 끝으로 이동하기 전에 개두술의 꼬리 및 꼬리 경계에 도달하도록 합니다.
    메모: 블레이드를 삽입하기 전에 듀라를 제거하지 마십시오. 두께가 ~80μm인 쥐 경막7과 대조적으로, 쥐 경막은 상당히 얇고(세포층 두께가 몇 개에 불과함) 삽입 중 메스 날에 눈에 띄는 저항을 생성하지 않습니다. 각 동물이 일관된 부상을 입도록 각 마우스에 새 메스 날을 사용하십시오.
12. 입위 팔을 천천히 들어 올려 뇌에서 칼날을 제거합니다. 칼날을 제거한 후 즉시 뇌 표면에 다른 젤 폼 조각을 놓아 과도한 혈액이나 체액을 흡수하십시오.
13. 한편, 입위 주위 암을 제거하고 11번 메스 날을 폐기하십시오. 출혈이 멈추면 젤 폼을 제거합니다.
14. 에틸론이나 프롤렌과 같은 비흡수성 봉합사로 피부를 봉합하여 상처를 봉합합니다. 봉합사는 수술 후 9-10일 후에 제거해야 합니다.
15. 마우스를 홈 케이지로 되돌리고 마우스가 가열 패드에서 천천히 회복하고 고통의 징후가 있는지 모니터링하도록 합니다. 이소플루오란에 의한 마취로부터의 회복은 일반적으로 이소플루오란에서 제거된 후 2-5분 이내에 발생합니다. 흉골이 다시 누워있을 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
16. 수분 공급을 위해 0.5-1ml의 젖산 Ringer 용액을 피하로 투여합니다.

결과

그림 1: 개두술 부위를 묘사한 쥐 두개골의 개략도. 파란색 선은 시추할 영역의 경계를 식별하는 초기 표시를 나타냅니다. 상단 및 왼쪽 표시는 각각 관상 봉합사 또는 시상 봉합사의 아래 또는 측면에서 1mm 떨어진 곳에서 측정됩니다. 하단 및 오른쪽 표시는 각각 관상 봉합사와 시상 봉합사에서 4mm 떨어진 곳에서 측정됩니다. 개두술은 표시된 경계(점선) 내에 원을 뚫어 직경이 약 3mm(점선)인 개두술을 만들어 수행됩니다. 회로도는 확장되지 않습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스테레오택스	하버드 기구	726049
고속 마이크로 드릴	하버드 기구	724950
스테인레스 스틸 메스 블레이드, #11	메드벳	JOR581S
5/45 각진 집게	정밀 과학 도구	11251-35
젤폼 스펀지 12cmx7mm	어부	NC9841478
항체 및 다른 시약	생산자	카탈로그 번호	희석 (명시야) 희석(형광)
Rb 안티 GFAP	다코	Z033429-2	1:20K 1:1케이
SHP 안티 BrdU	아브캠	AB1893	1:2K 1:500h
비오틴화 염소 안티 토끼	벡터 연구소	BA-1000	07:40h
비오틴화 토끼 안티 양	벡터 연구소	BA-6000	07:40h
Alexafluor 488 염소 안티 토끼	생명 기술	A-11008	07:40h
Alexafluor 568 당나귀 안티 양	생명 기술	A-21099	17:40h
DAPI 핵산 얼룩	생명 기술	D3571	17:40h
크레실 바이올렛 아세테이트	시그마 알드리치	C5042-10G	1%