리스테리아 모노사이토제네스 감염에 따른 쥐 뇌의 박테리아 집락화 평가

초록

출처: Ghosh, P., et al., 리스테리아 모노사이토제네스 뇌 감염. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 리스테리아 모노사이토제네스에 감염된 관류된 쥐 뇌의 감염성 박테리아 부하를 정량화하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 장기 적출 및 세균 부담 측정

1. 관류 후 부착된 혈관 구조와 인대를 조심스럽게 제거하고 5mL의 멸균 냉(4°C) PBS가 들어 있는 멸균 15mL 원뿔형 튜브에 장기를 별도로 배치하여 장기(예: 간, 비장)를 채취합니다. 추가 처리가 이루어질 때까지 얼음 위에 샘플을 보관하십시오.
2. 뇌를 적출하려면 가위를 사용하여 귀 뒤의 머리를 자르고 동물의 눈 사이 두피 피부를 정중선 아래로 자릅니다. 필요한 경우 가위를 두개골에 대고 누른 상태에서 여분의 조직을 잘라냅니다.
   1. 가위의 한쪽 끝을 매그넘 구멍(척수가 통과하는 두개골 바닥의 구멍)에 부드럽게 삽입하고 양쪽 두개골을 옆으로 자릅니다.
   2. 설치류의 눈 사이 두개골을 부드럽게 잘라 정중선을 따라 옆 압력을 가합니다. 뇌를 교란하지 말고 뇌 조직과 가위 사이의 접촉을 최소화하십시오.
   3. 가는 집게를 사용하여 두개골을 열어 뇌를 노출시키고 뇌 아래쪽과 두개골 기저부 사이에 주걱을 놓아 뇌를 제거합니다.
      메모: 그 결과 뇌 신경 섬유가 찢어집니다.
   4. 5mL의 멸균 차가운 PBS가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브에 뇌를 조심스럽게 옮깁니다.
   5. 쥐 사체를 버리고 나머지 동물에 대해 이 단계를 반복합니다.
      메모: 모든 장기를 적출한 후 시술 부위를 세척하고 장기 균질화를 준비하여 세균 부담을 확인합니다.
3. 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 각각 들어 있는 5% 표백제, 멸균수, 75% 에탄올 및 멸균수에 팁을 삽입하고 균질화기를 10초 동안 순차적으로 실행하여 생물 안전 캐비닛에 놓인 조직 균질화기의 팁을 세척 및 살균합니다.
4. 눈에 보이는 조직 조각이 남지 않을 때까지 15mL 원뿔형 튜브에서 감염된 뇌를 균질화합니다(설정 6에서 ~20초, 최대 rpm).
   1. 1.3단계에서 설명한 대로 균질기를 세척하여 다음 장기 샘플로의 박테리아 이월 오염을 방지합니다.
   2. 다른 모든 기관(예: 간, 비장)에 대해 균질화 과정을 수행합니다.
   3. 균질화 과정이 완료되면 1.3단계에서 설명한 대로 균질기를 세척하고 나중에 사용할 때까지 보관하십시오.
5. 멸균 PBS에서 장기 균질화의 10배 연속 희석액을 준비하고 BHI 한천/스트렙토마이신 플레이트에 희석액을 플레이트하여 장기당 CFU를 측정합니다.
   참고: 혈액 mL당 CFU를 결정하기 위해 유사한 방법이 수행됩니다.
   1. 모든 희석액을 도금한 후 플레이트를 37°C 인큐베이터로 밤새 옮깁니다.
   2. 다음 날, 각 플레이트의 콜로니 수를 세어 다음과 같이 장기 또는 혈액 mL당 총 박테리아 수를 계산합니다.
      CFU/장기 = (콜로니 수 x 희석 계수) / 도금된 균질산염 mL x 5
      혈액의 CFU/mL = (콜로니 수 x 희석 계수) / 도금된 혈액의 mL

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
뇌 심장 주입 매체	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	237200
스트렙토마이신 설페이트	암레스코	0382-50지
페트리 접시	폭스바겐	25384-342
글리세롤	폭스바겐	제97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX 기본 균질화기	이카	3352109	모델: T18BS1
분광 광도계	벡크만 쿨터	DU 800 시리즈
BALB/c 마우스	잭슨 연구소	모델 #000651
에틸렌디아민테트라아세트산	시그마-알드리치	60004
15ml 원뿔형 튜브	폭스바겐	21008-918
인산염 완충 식염수	코 닝	46-013-CM
스테인레스 스틸 주걱	폭스바겐	82027-520
스테인리스 스틸 가위(4.5인치)	폭스바겐	82027-578
스테인리스강 파인 팁 집게(6인치)	폭스바겐	82027-406

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