Detection of Orexin and Cannabinoid Receptor Co-localization in Diet-Induced Obese Zebrafish(다이어트 유도 비만 제브라피시에서 Orexin and Cannabinoid Receptor Co-localization in Diet-Induced Obese Zebrafish)

초록

출처: Imperatore, R., et al. 면역과산화효소 및 면역형광법을 사용한 성체 제브라피쉬의 오렉신 및 엔도칸나비노이드 수용체 식별. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 면역형광을 사용하여 정상 및 식이 유도 비만(DIO) 성인 제브라피시 뇌 조직에서 오렉신과 카나비노이드 수용체의 공동 국소화를 조사하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 면역형광 프로토콜

1. 조직 해부
   1. 제브라 피쉬를 얼음물 (얼음 5 : / 물 1, 4 ° C)에 담그면 제물로 바쳐야합니다. 저산소증으로 사망하기 위해 모든 움직임이 멈출 때까지 그대로 두십시오.
   2. 면도날로 머리를 제거하십시오. 집게로 두개골의 복부 쪽에서 연조직을 제거합니다. 두개골을 열고 뇌의 복부 쪽에서 뼈를 제거합니다. 뇌의 등쪽에서 피부와 두개골 뼈를 제거합니다. 뇌를 제거하십시오.
2. 조직 고정
   1. 4°C에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 3시간 동안 담가두어 뇌를 고정합니다.
      1. 1.755g의NaH2PO4H2O와 4.575g의 Na2HPO4를 450mL의 증류수(_dH2O)에 용해시켜 0.1M 인산염 완충액(PB)을 준비하고 필요한 양의 NaOH 1N으로 pH 7.4로 조정한다.
      2. 열판에서 교반하여 0.1M PB(pH 7.4) 100mL에 PFA 4g을 용해하는 4% PFA를 준비합니다. 60 ° C의 온도에 도달하면 NaOH 1N 2-4 방울을 첨가하여 명확한 용액을 얻습니다. 실온(RT)에서 PFA 4%를 방치하고 pH를 조절합니다. pH를 7.4.
         로 조정합니다. 메모: 고정 시간은 조직 크기에 따라 다릅니다. 4-6시간 이상 조직을 고정하면 항원을 가리고 항체-항원결정기 결합을 제한하는 과고정이 발생할 수 있습니다.
3. 조직 임베딩
   1. 0.1M PB(pH 7.4)로 티슈를 각각 5분 동안 3회 헹굽니다.
   2. cryoprotection를 위해, PB (0.1 M, PH 7.4)에 있는 20% 자당에 조직을 옮기고 4 °C에 밤새 유지하십시오. 그런 다음 조직을 0.1M PB(pH 7.4)에서 30% 자당으로 옮기고 4°C에서 추가로 하룻밤 동안 보관합니다.
   3. 최적 절단 온도(OCT) 화합물 블록에 조직을 삽입합니다. 이렇게하려면 액체 질소의 작은 듀어를 준비하고 알루미늄 호일을 반으로 잘라 팬을 만듭니다. OCT 화합물로 채워진 조직이 들어 있는 팬은 OCT 화합물이 냉각될 때까지 액체 질소에 담가야 합니다. 얼어붙은 조직은 절편화될 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
4. 조직 절단
   1. 동결 조직 블록을 -20°C의 저온 유지 장치로 옮기고 10μm의 관상 또는 시상 절편을 절단합니다.
   2. 면역조직화학에 적합한 접착 유리 슬라이드에 교대로 연속된 절편의 조직을 모으고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
      메모: -20°C에서 4°C 사이의 슬라이드는 어두운 슬라이드 상자 또는 슬라이드 북에 보관하십시오.
5. 비특이적 결합 부위 차단 및 조직 투과화
   1. 내용제성 펜으로 슬라이드의 조직 영역을 구분합니다.
   2. 0.1M PB(pH 7.4)로 섹션을 각각 5분 동안 3번 헹굽니다.
   3. 투과화 완충액 PB-Triton X-100 0.3%(PB-T)에 용해된 1% 정상 당나귀 혈청으로 절편을 RT에서 30분 동안 배양하여 세포막을 투과화하고 비특이적 결합 부위를 차단합니다.
      1. 0.1M PB(pH 7.4) 100mL에 Triton X-100 0.3mL를 0.3% 용해하는 Triton X-100을 준비합니다.
      2. 0.3% TritonX-100.
         를 함유한 PB에 1% 일반 당나귀 혈청을 용해하는 차단 용액을 준비합니다. 메모: 투과화 및 차단 완충액에 사용되는 혈청의 동물 종은 2차 항체의 숙주에 의존합니다.
6. 1차 항체를 혼합한 배양
   1. 0.1M PB(pH 7.4)로 섹션을 각각 5분 동안 3번 헹굽니다.
      1. PB-T에 희석된 1차 항체를 혼합하여 RT의 습한 상자에서 절편을 밤새 배양합니다. 1 차 항체의 1 차 항체 혼합을 사용할 수 있습니다 : 1 : 100 희석 된 오렉신 수용체 (OX-2R)에 대한 염소 항체 / 1 : 100 희석 된 카나비노이드 수용체 (CB1R)에 대한 토끼 항체 또는 1 : 100 희석 된 오렉신 펩타이드 (OX-A)에 대한 염소 항체 / 1 : 100 희석 된 CB1R에 대한 토끼 항체.
7. 2차 항체를 혼합한 배양
   1. 0.1M PB(pH 7.4)로 섹션을 각각 5분 동안 3번 헹굽니다.
   2. RT에서 2시간 동안 절편을 1) 당나귀 항토끼 Alexa Fluor 488-접합 2차 항체와 당나귀 항염소 Alexa Fluor 594-복합 2차 항체의 혼합물을 PB-T에 1:100으로 희석하여 배양합니다. 또는 2) 당나귀 항염소 Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody와 당나귀 anti-rabbit Alexa Fluor 594-conjugated secondary antibody의 혼합, PB-T.
      에서 1:100으로 희석된 메모: 동일한 동물 숙주에서 개발된 2차 항체를 사용합니다. 정상 혈청은 동일한 종의 2차 항체에 속해야 합니다(예: 당나귀에서 개발된 2차 항체와 당나귀 정상 혈청을 사용). 1차 및 2차 항체를 세제가 포함된 차단 버퍼로 희석하여 세포 투과성을 높이고 배경을 줄입니다.
8. 조직 장착
   1. 0.1M PB(pH 7.4)로 섹션을 각각 5분 동안 3번 헹굽니다.
   2. 핵 염료 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)로 1.5μL의 DAPI(1mg/mL)를 3mL의 PB에 용해시켜 절편을 대조염색합니다.
   3. 장착 매체가 있는 커버슬립 슬라이드(재료 표 참조). 이 수성 장착 매체는 장기간 사용을 위해 조직 샘플과 염색을 안정화합니다. 형광 샘플은 4°C의 어두운 곳에 보관할 수 있습니다. 형광단의 수명을 연장하려면 퇴색 방지 장착 매체를 사용하십시오.
      메모: 좋은 장착 매체를 선택하십시오. 실장제의 가장 중요한 매개변수 중 하나는 굴절률(nD)이며, 이는 유리의 굴절률인 약 1.5여야 합니다. 여기에 사용된 장착 매체는 특히 효소 및 지질 측정을 위해 준비된 시료(즉, 일련의 알코올로 탈수해서는 안 되는 시료)와 함께 사용할 수 있습니다.
9. 컨트롤
   1. 섹션 1.1–1.8을 반복하여 1차 또는 2차 항체를 생략하거나 특정 단계에서 1차 또는 2차 항혈청을 PB(음성 대조군)로 대체합니다.
   2. 섹션 1.1–1.8을 반복하여 상대 펩타이드(펩타이드 100mg/희석된 항혈청 1mL)를 초과하여 각 1차 항체를 사전 흡수합니다.
   3. 마우스 뇌 슬라이스(양성 대조군)에서 섹션 1.1–1.8을 반복합니다.
      메모: 시작하기 직전에 모든 버퍼를 새로 준비합니다. 각 단계에서 섹션 주위에 피펫 또는 여과지를 사용하여 과도한 유체를 조심스럽게 제거하고 섹션을 항상 습하게 유지하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티 CB1	아브캠	AB23703
안티 OX-2R	산타 크루즈	사우스캐롤라이나-8074
안티 OXA	산타 크루즈	SC8070
저온 유지 장치	라이카 바이오시스템	CM3050S
다피	시그마 알드리치	32670
당나귀 anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary 항체	써모 피셔	A11055
당나귀 anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체	써모 피셔	A11058
당나귀 항토끼 Alexa fluor 488-conjugated secondary 항체	써모 피셔	A21206
당나귀 항토끼 Alexa fluor 594-conjugated secondary 항체	써모 피셔	A21207
에탄올 앱솔루트	폭스바겐	2,08,21,330
냉동 단면 화합물	라이카 바이오시스템	FSC 22 동결 섹션 미디어
염산(HCl)	폭스바겐	2,02,52,290
ImmPACT 소량	벡터 랩	SK4105
현미경	라이카 바이오시스템	DMI6000
마이크로톰	라이카 바이오시스템	RM2125RT
나2HPO4	시그마 알드리치	S9763
염화나트륨	시그마 알드리치	S7653
나H2포4H2영형	시그마 알드리치	S9638
나오	시그마 알드리치	S8045
노멀 당나귀 세럼	시그마 알드리치	D9663
노멀 래빗 세럼	벡터 랩	S-5000
파라포르알데이드	시그마 알드리치	P6148
트리톤 X-100	Fluka 분석	93420
트리즈마	시그마 알드리치	T1503
VectaStain Elite ABC 키트	벡터 랩	PK6100